基于別構調節機制的HIV-1整合酶抑制劑研究進展

邢楊，葉飛，楊琳，張維，蘇希鵬，劉冰冰

作者單位：100067 北京市安全生產科學技術研究院職業衛生研究中心

人類免疫缺損病毒（human immunodeficiency virus，HIV）通過入侵人類免疫系統，破壞防御體系，殺死免疫系統細胞，致使被感染者患上獲得性免疫缺陷綜合征（acquired immune deficiency syndrome，AIDS）。自 1981 年艾滋病被首次發現以來[1]，其傳播速度越來越快、傳播范圍越來越廣。2017 年聯合國艾滋病規劃署（The Joint United Nations Programme on HIV and AIDS，UNAIDS）統計顯示，全世界范圍內艾滋病患者已達 3700 萬人，其中接受抗逆轉錄病毒治療的患者達 2100 萬人，新增艾滋病患者達 180 萬人[2]。由于 10% ～ 60% 的艾滋病病毒感染者在初期并未顯現任何癥狀，大部分病毒攜帶者并未意識到已感染艾滋病病毒。美國疾病預防工作小組針對此問題建議對艾滋病病毒攜帶者及感染者進行全面篩查，其中包括青年人、老年人及孕婦[3]，進而降低病毒擴散速度，盡早防范艾滋病的傳播。

HIV 在體內復制包括感染、逆轉錄、整合、轉錄和包裝五個過程。首先，HIV 與宿主輔助性 T 細胞表面融合并進入細胞，破裂釋放 2 個核糖核酸（RNA）和 3 種酶（逆轉錄酶、整合酶和蛋白酶）；HIV 通過逆轉錄酶將其 RNA信息復制到 DNA；整合酶將病毒雙鏈 DNA 整合至宿主細胞染色體的 DNA 鏈中，形成前病毒基因，并通過宿主RNA 聚合酶形成一條新的 RNA 鏈。HIV 感染過程所需的3 種酶中，HIV-1 整合酶對病毒 DNA 整合到宿主細胞DNA 起重要作用。研發整合酶抑制劑成為治療艾滋病及抑制病毒傳播的重要方法。近年來陸續有研究表明整合酶抑制劑對治療艾滋病有較好作用。別構抑制劑是通過改變酶分子構象起到抑制酶活的作用。通過總結基于別構調節機制的HIV-1 整合酶抑制劑研究進展，將有助于新型整合酶抑制劑的開發及艾滋病職業暴露風險評估研究。

根據 HIV-1 整合酶的作用可開發防御 HIV-1 藥物。在過去的 20 年中，已發現許多 HIV-1 整合酶抑制劑[4-5]。長期服用一類藥物，病毒易產生交叉耐藥性，亟需開發新型化學療法來抑制病毒對人體的侵襲。1996 年，美籍華裔科學家何大一提出高效抗逆轉錄治療方法。該方法通過聯合使用3 種或 3 種以上的抗病毒藥物來達到治療艾滋病的目的。它彌補了單一用藥產生的抗藥性的缺點，可最大限度抑制病毒復制，從而部分甚至全部恢復機體免疫功能，延緩病程，延長患者生命，提高生活質量[6]。2010 年，Nature刊登了一篇關于 DNA 鏈轉移抑制機制的文章，它揭示了 HIV-1整合酶在艾滋病病毒復制整合的作用過程[7]。2012 年，Bojja等[8]研究了 HIV-1 整合酶多聚體的分子聚合形態，對后續開發新型整合酶抑制劑具有重要意義。整合酶結構及作用機制的發現促進了整合酶分子別構調節機制的研究。近年來，關于整合酶多聚體的定向轉化調節及別構抑制劑的研發受到研究者的廣泛關注。本文對近年來關于 HIV-1 整合酶結構及基于別構調節機制的 HIV-1 整合酶抑制劑研究情況進行總結。

1 HIV-1 整合酶結構

HIV-1 整合酶蛋白質分子量為 32 kD，其蛋白質分子鏈分為三個區域，即 N 端結構域（NTD）、核心結構域（CCD）和 C 端結構域（CTD）。HIV-1 整合酶分子存在多種聚合形式，有二聚體分子、四聚體分子、八聚體分子和高聚體分子。整合酶的三個結構域對多聚體的形成及 DNA 對整合酶吸附具有重要作用。一般來說，重組蛋白溶解性較差，很難獲取原子水平的重組蛋白結構的相關信息。研究者們通過選取蛋白質分子結構中的單一區域或兩個區域進行研究。2010 年科學家通過解析吸附在 DNA 鏈端的原型泡沫病毒整合酶結構來研究 HIV-1 整合酶分子結構[7]。研究發現HIV-1 整合酶多聚體分子中起催化整合作用的主要是四聚體分子。研究發現整合酶四聚體分子是通過兩個整合酶二聚體分子聚合而成。此發現為開發別構調節抑制劑提供理論依據[8]。

研究酶的活性位點是進行生物酶動力學研究的第一步。HIV-1 整合酶分子中存在多類活性位點，如：鏈轉移和3'-加工端反應的活性位點，影響因子 LEDGF/p75 及鏈轉移抑制物結合的位點。此外，研究者們發現整合酶存在可供不同小分子吸附的結合位點。Wielens 等[9]發現一類小分子的結合位點，此位點包含殘基 Tyr83、Try108、Asn184、Ile200和 Val201。Wielens 等[10]發現可吸附蔗糖分子的活性位點，殘基包含 Asp64、Asp116、Asn144、Gln146、Gln148 和Glu153。

2 HIV-1 整合酶催化機制

HIV-1 整合酶將 HIV 的基因整合到宿主細胞 DNA鏈上，主要發生兩類親核反應：3'-終端過程和鏈轉移過程[11]。不同的反應過程中，HIV-1 整合酶分子結構多聚體形態發生變化。3'-終端反應過程發生在細胞質中，兩個二聚體整合酶分子分別吸附在病毒雙螺旋 DNA 分子鏈的 3'-端，催化脫除 2 個二核苷酸分子，使活性基團羥基暴露出來，形成預整合混合物。鏈轉移過程發生在細胞核中，吸附在病毒DNA 鏈兩端的整合酶二聚體分子相互聚攏，形成一個新的四聚體整合酶分子。在 LEDGF/p75 作用下，整合酶切斷目標 DNA 鏈，催化病毒 DNA 整合到宿主 DNA 鏈上。最后，通過宿主蛋白酶修復 DNA 鏈的連接端并完成 DNA序列復制，形成一條含有病毒 DNA 的分子鏈。在病毒基因復制過程中，整合酶的多聚體形態變化起到了重要作用。因此，可以通過干預整合酶多聚體構象變化，添加某種抑制劑定向轉化多聚體，從而達到抑制整合酶催化作用。

圖 1 可能存在的整合酶結合形式（白點代表核心結構域上的活性位點）

3 別構調節劑

3.1 多聚體的形成

游離在溶液中的整合酶分子存在二聚體與四聚體相互轉化的動態平衡[12]。整合酶的聚合形式因分子濃度變化而變化。100 ～ 200 nmol/L 濃度下，游離狀態的整合酶主要以四聚體形式存在于溶液當中。當蛋白質濃度高于 250 nmol/L時，整合酶分子易發生絮凝[13]。四聚體整合酶-DNA 混合物的形成條件是 DNA 兩端的二聚體整合酶分子相互聚攏，而游離的四聚體并不會吸附在病毒 DNA 鏈的兩端[14]。可見，病毒 DNA 兩端吸附二聚體整合酶對 3'-端過程反應起重要作用，而 DNA 兩端吸附的四聚體對隨后的整合過程至關重要[15]。病毒 DNA 長末端重復序列可誘導病毒 DNA分子與二聚體整合酶的吸附。由于 DNA 主要與二聚體相互作用，在二聚體與四聚體動態平衡中，DNA 的存在會使體系中二聚體含量升高。HIV-1 整合酶從多聚體轉化成為二聚體，同時伴有 DNA 的吸附反應。

鏈轉移反應需要影響因子 LEDGF/p75 的參與，它可激活體內或體外細胞中吸附在 DNA 兩端的整合酶形成四聚體，并綁定其共同進入宿主的染色體內。研究如何抑制鏈轉移反應或整合酶的聚合的過程成為開發新藥物的主要途徑。介于 LEDGF/p75 對病毒入侵人體細胞的重要作用，IN-LEDGF/p75 也成為開發新型抗 HIV-1 藥物的研究熱點。LEDGF/p75 分子結構包含兩個結構域，即 N-terminal Pro-Trp-Trp-Pro 結構域（PWWP）和整合酶吸附結構域（intergrase-binding domine，IBD）[16]。其中，IBD 結構域可促進 LEDGF/p75 與整合酶的吸附。

3.2 酶分子聚合形式

蛋白質基本結構單元間的連接方式有以下幾種：結構域交換、非共價和共價連接。Bojja 等[8]發現 HIV-1 整合酶存在兩類二聚體的結合形式，延伸二聚體和核心區結合二聚體。延伸二聚體的結構穩定性主要靠分子的兩個基本結構單元的結構域緊密結合形成，這種結合包含兩個方面，一方面是兩個基本結構單元中的其中一個單元的 C 端結構域、N 端結構域與另一個單元的催化核心區域緊密結合，另一方面是兩個結構單元的 C 端結構域緊密結合（圖 1）。另一種結合叫核心區結合，主要是通過兩個結構單元中核心結構域的緊密貼靠穩定分子結構。以上所提到的單個結構單元和二聚體的結合形式已在禽肉瘤病毒的單分子結構和二聚體結構中發現并報道過。在原型泡沫病毒的結晶結構中也曾發現過含有由核心結構域緊密結合而形成的二聚體結構。

整合酶四聚體分子結構如圖 2 所示。由于 N 端結構域與核心結構域間的疏水作用，延伸二聚體存在區交換現象。為了獲得更大的疏水結構區，N 端結構域與其他二聚體的 N 端結構域結合，形成以核心域與核心域相互作用的四聚體酶分子（圖 2）。

酶是一類具有催化作用的蛋白質分子，其四級結構對蛋白質的活性起重要作用。蛋白質分子構象的穩定性與其生物學活性息息相關，外界溫度和 pH 對蛋白質分子結構影響也較大。別構調節是指通過誘導蛋白質構象變化而抑制蛋白質分子活性[17]。基于蛋白質分子的這一特性研發的酶抑制劑叫作別構調節劑[18]。關于別構酶的催化動力學模型主要有 MWC（Monod-Wyman-Changeux）、KNF（Koshland-Nemethy-Filmer）和 Morpheein 模型。其中，MWC 模型由 Monod 等[19]提出。此模型適用于酶分子結構單元存在兩種構象，同種構象的蛋白質結構單元可形成一個酶分子，并且兩種不同構象的酶分子之間可以相互轉化，底物可吸附在任一種狀態的結構單元上。KNF 模型適用條件：一個酶分子的結構單元會在活性和非活性兩種狀態下轉變，即一個酶分子中可同時存在兩種狀態的結構單元，且底物特異性地吸附在具有活性的結構單元上。Morpheein 模型（圖 3）是研究異構酶動力學的重要模型之一，它描述了酶分子四級結構異構體相互轉化的情況[20]。如圖 3A 所示，酶的某種構象的結構單體可轉化成另一種構象的結構單體。不同的單體又可進一步形成新的多聚體。反應的底物即可吸附于單體，也可吸附于多聚體。利用 HIV-1 整合酶構象變化研究新型抑制劑的研究方向受到廣泛關注[21]。已有研究表明 HIV-1 整合酶分子存在二聚體與四聚體的形式。通過調節整合酶多聚體平衡，定向促進二聚體向四聚體轉化，進而減弱游離的整合酶與 DNA 相互作用能力。此類機制下酶的動力學研究可運用 Morpheein 模型進行分析[22]。

圖 2 二聚體與四聚體的結構

圖 3 Morpheein 模型

3.3 多肽小分子類抑制劑

根據 HIV-1 整合酶的催化特性，研究者們發現了一種可吸附于 HIV-1 整合酶四聚體上的多肽小分子[23-24]，這是首次發現可以利用小分子來調節整合酶核心催化域與影響因子間的相互作用，進而抑制整合酶的催化活性。

有研究表明從 LEDGF 中截取的肽可以吸附在 HIV-1整合酶上，并抑制整合酶的活性。這類抑制物主要吸附在四聚體的核心域結合處，穩定整合酶的四聚體結構[25-26]。隨著抑制劑的加入，整合酶二聚體分子不斷轉化為四聚體分子。由于游離的整合酶四聚體分子是不能催化病毒 DNA 整合反應，從而抑制病毒 DNA 對高活性的整合酶二聚體分子的吸附[27]?？梢娦》肿与囊脖唤凶髯儤嬕种苿┗蜣D換肽，可調節酶的活性狀態與非活性狀態間的轉換平衡。目前，大部分研究小分子肽吸附整合酶的過程主要采用 Hill 方程進行分析。Morpheein 模型（圖 3B）也可用于整合酶的動力學研究。相比于傳統的 Morpheein 模型，整合酶的Morpheein 模型是多聚體間的直接轉化，而不需要中間不同構象單體的轉化。研究者們還從逆轉錄蛋白酶中成功提取小分子肽，并應用于抑制整合酶的活性研究當中。研究發現逆轉錄蛋白中提取的小分子肽同樣可調節整合酶多聚體的動態平衡，促進整合酶的活性態向非活性態轉化。2017 年8 月，一份關于 peptide 的專利被成功授權，可成功分離peptide 并用于 HIV/AIDS 的治療[28]。

3.4 喹啉乙酸類抑制劑

Kessl 等[29]研究了兩種喹啉乙酸類物質對 HIV-1 整合酶與 LEDGF 相互作用的影響。研究發現此類物質有助于整合酶多聚體的形成。喹啉乙酸類物質濃度越高，越有利于形成整合酶多聚體。2016 年俄亥俄州立大學研究者們探討了含有吲哚結構的整合酶抑制劑的作用[30]。他們采用骨架遷越方法合成一系列變構 HIV-1 整合酶抑制劑。結果表明這類物質可以吸附在整合酶二聚體分子間的結合面，也是吸附 LEDGF/p75 的活性位點，進而調節整合酶的多態性，抑制整合酶活性。

4 展望

別構抑制劑的添加實現了 HIV-1 整合酶蛋白質分子定向轉化為四聚體，可有效抑制 DNA 與 HIV-1 整合酶的相互作用。別構調節劑通過吸附 LEDGF 的結合位點或穩定四聚體構象，達到調節 HIV-1 整合酶分子構象，抑制整合過程的發生。繼續研究蛋白質分子構象對開發新型藥物具有重要的作用。目前絕大多數關于 HIV-1 整合酶的研究采用Hill 方程，此方法可推算出蛋白質分子結構單元數，但無法獲取蛋白質在催化過程中的構象變化的相關信息?；贖IV-1 整合酶的分子結構特點，未來可采用 Morpheein 動力學模型研究 HIV-1 整合酶動力學及其構象變化，篩選最佳治療艾滋病的藥物。