人類BRAF 基因突變檢測試劑盒性能評價

游延軍，胡澤斌，蒲小聰，楊達梅，龍騰鑲，高飛

作者單位：611731 成都，四川省食品藥品檢驗檢測院（游延軍、蒲小聰）；611731 成都，邁克股份有限公司（楊達梅、龍騰鑲）；100050 北京，中國食品藥品檢定研究院體外診斷試劑所非傳染病診斷試劑室（胡澤斌、高飛）

BRAF 基因位于 7q34，長約 190 kb，編碼絲/蘇氨酸特異性激酶。該激酶是 RAS/RAF/MEK/ERK/MAPK 信號通路最為關鍵的激活因子，參與調控細胞的生長、分化、增殖及凋亡等[1]。BRAF 基因主要有兩種突變類型：11% 的突變發生在編碼甘氨酸環的 11 號外顯子上，如 G463、G465、G468 等點突變；89% 的突變發生在編碼激活區的15 號外顯子上，其中 80% ～ 90% 的突變位于第 1799號堿基上，T 突變為 A（T1799A），導致其編碼的纈氨酸被谷氨酸取代（V600E）[2]。在多種人類惡性腫瘤中，如惡性黑色素瘤[3]、結直腸癌[4]、非小細胞肺癌[5]、甲狀腺癌[6]等均存在不同比例的 BRAF 突變。研究表明，BRAF 基因發生V600E 突變時，病患無法從抗 EGFR 的相關靶向藥物的治療中獲益，而且還可導致部分 KRAS 基因野生型患者對EGFR 靶向藥物治療不敏感[7]。在腫瘤個性化治療高速發展的現在，檢測 BRAF 基因 V600E 的突變狀態，能夠為臨床醫生對腫瘤患者制定個性化治療方案提供很好的依據，提高患者的生存率，減少盲目用藥，減少病患家庭的經濟壓力。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本 本研究的樣本是采用石蠟包埋組織提取的核酸樣本經標化制備的企業參考品，保存條件為 –10 ～ –30 ℃。

1.1.2 儀器和試劑 評價試劑為 A 公司的人類 BRAF基因突變檢測試劑盒（熒光 PCR 法），擴增分析儀器采用美國 ABI 公司的 7500 熒光定量 PCR 儀；對比試劑為經過國家食品藥品監督管理部門審批的已上市的 B 公司的人類 BRAF 基因 V600E 突變檢測試劑盒（熒光 PCR法）。

1.2 方法

1.2.1 準確性 檢測人類 BRAF 基因突變經標化的陽性企業參考品 P1 ～ P3，檢測結果應為突變陽性。

1.2.2 特異性 檢測人類 BRAF 基因突變經標化的陰性企業參考品（野生型人類基因組）N1 ～ N4，檢測結果應為野生型；檢測試劑盒檢測范圍外的人類 BRAF 基因突變經標化的企業參考品 N5 ～ N9，檢測結果應為未檢出突變；檢測非人類基因組樣本 N10，檢測結果應為未檢出突變。

1.2.3 最低檢測限 10 ng 野生型人類基因組背景下，對突變比例為 1.0% 的 BRAF 基因 V600E 突變參考品 L1進行檢測，檢測結果應為突變陽性。

1.2.4 重復性 陰性參考品（野生型）R1，檢測結果應均為野生型；陽性參考品 R2 ～ R3，檢測應為突變陽性且 Ct值批內變異系數（CV%）應不大于 5.0%。

1.2.5 抗干擾能力 將弱陽性企業參考品 L1（10 ng 野生型人類基因組背景下，突變比率低至 1%），平均分成 3 組，向樣本中分別加入等體積不同濃度的蛋白酶 K、甲醛和乙醇，同時采用純化水加入樣本作為對照，判斷是否存在干擾，Ct 均值差異 ≤ 1.0 為無干擾，Ct 均值差異 ＞ 1.0 為有干擾。

1.2.6 臨床比對 分別用 A 公司人類 BRAF 基因突變檢測試劑盒（熒光 PCR法）和 B 公司比對試劑盒檢測相同的臨床樣本 156 例，進行兩個試劑盒的一致性評價。

2 結果

2.1 準確性

陽性企業參考品 P1、P2、P3，每個參考品重復一次，檢測結果見表 1，根據判定規則（下同）：ΔCt = Ct體系II–Ct體系I，若 ΔCt ≤ 9，表明樣本為 BRAF 基因 V600E 突變陽性；若 ΔCt ＞ 9，表明樣本為 BRAF 基因 V600E 突變陰性。檢測結果均為突變陽性。

表 1 陽性企業參考品檢測結果

2.2 特異性

陰性企業參考品（N1 ～ N10），每個參考品重復 1 次，檢測結果見表 2，檢測結果均為野生型或未檢出突變。

2.3 最低檢測限

10 ng 野生型人類基因組背景下，對突變比例為 1.0%的 BRAF 基因 V600E 突變參考品（L1）進行檢測，重復3 次，檢測結果見表 3，檢測結果均為突變陽性。

表 2 陰性企業參考品檢測結果

表 3 最低檢測限企業參考品檢測結果

2.4 重復性

2.4.1 重復性企業參考品 R1 連續檢測重復 10 次，檢測結果如表 4，檢測結果均為野生型。

表 4 重復性企業參考品 R1

表 5 重復性企業參考品 R2

表 6 重復性企業參考品 R3

2.4.2 重復性企業參考品 R2 連續檢測重復 10 次，檢測結果見表 5，檢測結果為突變陽性且對應體系 Ct 值批內變異系數（CV%）分別為 0.27%、0.68%；重復性企業參考品 R3，連續檢測重復 10 次，檢測結果見表 6，檢測結果為突變陽性且對應體系 Ct 值批內變異系數（CV%）分別為 0.19%、0.65%。

2.5 抗干擾能力

2.5.1 蛋白酶 K 的殘留含量對試劑擴增的影響 在擴增樣本中加入等體積的不同濃度的蛋白酶 K，使反應體系中終濃度為 0%、0.0075%、0.075%、0.75%、7.5%，檢測結果如表 7，終濃度高于 0.0075% 蛋白酶 K 殘留會影響試劑擴增。

2.5.2 甲醛的殘留含量對試劑擴增的影響 在擴增樣本中加入等體積的不同濃度的甲醛，使反應體系中終濃度為0%、0.0075%、0.075%、0.75%、7.5%，檢測結果如表 8，終濃度高于 0.075% 的甲醛殘留會影響試劑擴增。

表 7 蛋白酶 K 的殘留量對擴增的影響

表 8 甲醛的殘留量對擴增的影響

2.5.3 乙醇的殘留含量對試劑擴增的影響 在擴增樣本中加入等體積的不同濃度的乙醇，使反應體系中終濃度為0%、0.0075%、0.075%、0.75%、7.5%，檢測結果如表 9，終濃度高于 0.75% 的乙醇殘留會影響試劑擴增。

表 9 乙醇的殘留量對擴增的影響

2.6 臨床比對

使用 156 例臨床石蠟包埋組織樣本比較 A 公司人類BRAF 基因突變檢測試劑盒（熒光 PCR 法）和比對試劑盒進行符合性分析，計算陽性符合率、陰性符合率、總符合率及 Kappa 系數，檢測結果如表 10。

表 10 同類產品比較結果

對兩種方法的檢測結果進行符合性分析，陽性符合率為100.00%，陰性符合率為 99.15%，總符合率為 99.37%，Kappa 系數為 0.98。表明兩種方法具有高度一致性。

3 討論

本產品以實時熒光定量 PCR 技術和引物特異性 PCR（ARMS）技術為平臺，特異性檢測 DNA 樣本中的 BRAF基因 V600E 突變。其中，試劑 1 中的特異性引物能夠在Taq 酶作用下靶向擴增 BRAF 基因野生型和突變型模板；試劑 2 中的特異性引物在 Taq 酶作用下只擴增突變型模板。通過兩者 Ct 差值實現 BRAF 基因 V600E 突變的定性檢測。

ARMS-PCR 是目前實驗室常用的基因突變檢測方法，主要優點為檢測靈敏度高，可檢測腫瘤細胞中突變比例為1% 甚至更低的突變基因[8]。

通過對 A 公司人類 BRAF 基因突變檢測試劑盒（熒光 PCR 法）的性能進行評價可知，該產品具有重復性好，靈敏度高和特異性強等特點，滿足行業標準和市場需求。