誘導多能干細胞移植治療對心肌梗死模型小鼠心功能的影響

熊挺淋 張麗莎 王浩宇 劉 濤

(南充市中心醫院心內科 川北醫學院第二臨床醫學院，四川 南充 637000)

心肌細胞(CM)是一種終末分化細胞，心肌梗死或者其他創傷導致CM死亡，其損傷是不可逆的。目前治療CM損傷性疾病是困擾臨床醫生的一大難題，主要采取組織或者細胞移植，組織移植包括自體心肌組織移植及異體心臟移植，胚胎干細胞、骨髓間充質干細胞已證實能分化為CM〔1，2〕而用于細胞移植等。但胚胎干細胞用于移植治療一直存在著道德倫理及免疫排斥反應等需要解決的問題。Takahashi等〔3〕將小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)成功重編程為多能性細胞——誘導多能干細胞(iPSCs)，iPSCs無論在生長特點、細胞形態、表達的標志物及形成畸胎瘤等方面均與胚胎肝細胞非常相似，且解決了胚胎肝細胞移植治療時存在的免疫排斥及道德倫理難題。Mauritz等〔4〕研究證實小鼠iPSCs可以在特定的體外培養條件下定向分化為CM，但在體內特定條件下其能否分化為CM，目前未見相關研究報告。本研究觀察iPSCs移植治療對心肌梗死小鼠心臟的保護作用。

1 材料和方法

1.1材料 成年昆明小鼠及受孕13.5 d的昆明小鼠均由川北醫學院動物實驗中心提供。綠色熒光蛋白(GFP)轉基因(Oct-4)小鼠來源的iPSCs株購自中國科學院動物研究所北京干細胞庫。 DMEM高糖培養基、胎牛血清、胰蛋白酶均購自Hyclone公司，水合氯醛、非必需氨基酸、二甲亞砜均購自Sigma，β-巰基乙醇購自天津TBD公司，絲裂霉素C購自Roche公司，白血病抑制因子購自上海欣百諾公司，山羊來源的心肌肌鈣蛋白(cTn)T一抗、四甲基異硫氰酸羅丹明(TRITC)標記的兔抗羊熒光二抗購自Santa Cruz公司，兔抗鼠縫隙連接蛋白(Cx)-43一抗及辣根過氧化物酶標記的二抗購自北京中杉金橋公司。簡易呼吸機由川北醫學院生理教研室提供，BL-420多導電生理儀及生物機能實驗系統為成都泰盟科技有限公司生產，體式鏡XTL-3A Coic由重慶光學儀器有限公司生產。

1.2iPSCs及原代CM的培養及鑒定 iPSCs的復蘇、培養、傳代和原代CM的提取、培養及兩種細胞的鑒定同熊挺淋〔5〕法。

1.3小鼠急性心肌梗死(AMI)模型的建立及判定 水合氯醛腹腔麻醉成年昆明小鼠，然后通過氣管切開由簡易呼吸機輔助通氣。通氣成功后，胸骨左緣第4肋間隙剪斷肋骨，進入胸腔，鈍性分離心包并剪開，體式鏡下用結扎線結扎前降支，結扎后成功的標志為結扎血管供應區心肌組織變蒼白，體表心電圖監測示相關導聯ST段抬高大于0.1 mV(圖1)。待移植細胞成功后，逐層關閉及縫合胸腔，待小鼠恢復自主呼吸后，撤去簡易呼吸機。術后給予手術小鼠肌肉注射青霉素以預防感染〔6〕。

圖1 心肌梗死模型及體表心電圖

1.4實驗分組 心肌梗死造模成功的昆明小鼠共36只，隨機分為AMI組、AMI+iPSCs組、AMI+CM組，每組12只；12只正常成年昆明小鼠設為正常對照(NC)組。AMI組：只建立心肌梗死模型，不移植iPSCs及原代CM；AMI+iPSCs組：將iPSCs移植入心肌梗死區；AMI+CM組：將原代CM移植入心肌梗死區；NC組：既不建立心肌梗死模型，也不移植細胞。

1.5細胞移植 分別收集iPSCs及原代CM，制備成細胞懸液，小鼠冠脈前降支結扎后30 min時，用微量注射器吸取移植細胞懸液2.5 μl注射入心肌肌層，每個缺血壞死區域分別注射4次〔6〕。

1.6心電圖及血流動力學的監測 正確連接多導電生理儀，采用BL-420多導電生理儀及生物機能實驗系統，分別于細胞移植后1 h、1 d、7 d、14 d、21 d時測動脈收縮壓及動脈舒張壓〔6〕。急性ST段抬高型心肌梗死，其抬高的ST段一般在7 d內回落至基線，因此分別在細胞移植后1 h、1 d、2 d、5 d及7 d時檢查體表心電圖。

1.7免疫組化檢測Cx-43的表達 實驗后第21天，開胸切取各組心肌梗死區心肌組織，采用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，然后切片。采用中杉金橋公司SP法免疫組化試劑盒進行染色操作。應用Image Pro Plus圖像分析軟件對目的蛋白進行分析。選擇5個高倍鏡視野計算平均光密度值，取平均值作為Cx-43的相對表達量。

1.8統計學方法 使用SPSS17.0統計軟件行單因素方差分析、LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1iPSCs和原代CM形態觀察及鑒定 小鼠iPSCs在飼養層細胞上呈集落狀圓形或者橢圓島狀生長，其內細胞生長緊密，同時iPSCs在熒光顯微鏡下觀察，呈現出與光學顯微鏡對應的、一致的集落狀綠色細胞團。CM呈多邊形、三角形或者扁平不規則等形態，培養第3天起，可見小部分收縮的CM，收縮頻率在30～50次/min，細胞免疫熒光染色后，胞質內可見發紅色熒光的心肌特異性蛋白cTnT(圖2)。

2.2iPSCs移植對小鼠心率的影響 造模前各組心率差別無統計學意義(P>0.05)，而造模成功后初期(7 d內)，各組小鼠心率均有輕度升高趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)。實驗第14天及21天，AMI+iPSCs組小鼠心率較造模成功后初期明顯降低(P<0.05)；細胞移植第14天后，AMI+iPSCs組小鼠心率明顯低于同時間點的AMI+CM組、AMI組及NC組小鼠心率(P<0.05)。而AMI+CM組、AMI組和NC組小鼠心率，造模前后差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.3iPSCs移植對心電圖ST段的影響 iPSCs移植后1 h及第1天時，AMI+iPSCs組體表心電圖ST段抬高程度與AMI組比較差異無統計學意義(P>0.05)；移植后第2天、第5天及第7天時，AMI+iPSCs組ST段抬高程度較AMI組明顯降低(P<0.05)。而相同時間點的AMI+CM組及AMI組的ST段抬高程度差異無統計學意義(P>0.05)。細胞移植后第2天起，AMI+iPSCs組ST段抬高程度較AMI+CM組明顯下降(P<0.05)。見表2。

2.4iPSCs移植對血壓的影響 與NC組相比，AMI+iPSCs組血壓無明顯下降(P>0.05)，而AMI+CM組及AMI組血壓明顯下降(P<0.05)；與AMI+iPSCs組相比，AMI+CM組及AMI組血壓也明顯下降(P<0.05)。見表3。

圖2 iPSCs及原代CM形態及鑒定(×400)

時間造模前造模后1 h1 d7 d14 d21 dAMI+iPSCs組424.50±42.76430.43±32.671)437.88±43.151)420.12±29.801)375.08±31.84385.64±22.77AMI+CM組418.42±36.71422.45±26.67423.90±33.81418.32±27.91417.03±22.232)420.45±30.462)AMI組426.88±29.02428.22±29.37419.20±38.78410.26±29.68417.28±30.122)412.55±40.002)NC組416.48±29.28420.36±28.70415.19±38.94418.34±35.62416.34±31.562)411.22±28.732)

與第14天及21天比較：1)P<0.05；與AMI+iPSCs組比較：2)P<0.05

表2 移植后不同時間點各組體表心電圖ST段抬高程度比較

與AMI組相比：1)P<0.05；與AMI+CM組相比：2)P<0.05

表3 各組血壓比較

與NC組相比：1)P<0.05；與AMI+iPSCs組相比：2)P<0.05

2.5免疫組化分析 iPSCs移植后第7天，缺血壞死周圍可見iPSCs植入，與正常心肌組織緊密結合，iPSCs稍呈集落狀生長。見圖3。定量分析顯示，移植后第21天，AMI+iPSCs組Cx-43平均吸光度(0.154±0.063)明顯高于AMI組(0.022±0.033)(P<0.05)；而AMI+CM組Cx-43平均吸光度值(0.019±0.010)與AMI組差異無統計學意義(P>0.05)。

圖3 心肌組織中的iPSCs及Cx-43免疫組化染色

3 討 論

許多體外實驗已證實iPSCs能夠定向分化為CM，其分化CM不論在細胞形態及表達特異性標志物方面均與原代CM相似〔4，7，8〕。Strauer 等〔9〕研究表明，骨髓單個核細胞移植治療10 w后，心肌梗死面積由24.6%下降至15.7%，射血分數、心臟指數增加了20%～ 30%，運動時的舒張末期容量下降30%，左室充盈壓相對下降，移植治療后沒有出現新的心肌缺血、炎癥反應和惡性心律失常等不良反應。此外，該研究團隊還首次證明了經冠狀動脈內輸入自體骨髓單個核細胞治療AMI是安全可行的〔10，11〕。本實驗表明，一定數量的iPSCs移植可在一定程度上改善心肌梗死小鼠心臟功能，并使移植區域Cx-43蛋白表達增加。

既往研究表明，永久性結扎冠狀動脈法與冰凍損傷或者暫時阻斷冠狀動脈的方法相比，這一技術更接近心肌梗死發生的病理生理過程，并且不會發生缺血再灌注時更為嚴重的惡性心律失常〔12〕。經外周靜脈注射移植，只有很少一部分的移植細胞能到達心肌梗死區；而且長時間的血液內循環過程中，有部分移植細胞會發生向脾、肝、肺等臟器歸巢的現象〔13〕。采用直接開胸心肌注射法，可以使移植細胞在注射后首先在梗死區及梗死周邊區停留，因而能夠使細胞移植效果最大化。iPSCs分化來源的心臟血管平滑肌細胞，具有成熟心肌細胞的興奮性、收縮性、自律性和電位穩定性等特點〔14〕，同時，干細胞移植可增加細胞因子，如血管內皮生長因子(VEGF)等的釋放，促進缺血區新生毛細血管的生成，增加心肌灌注、改善心室重構及減少心室擴張，因而有利于細胞的存活和增殖〔15〕。基于以上研究理論，本實驗表明心肌梗死后無泵衰竭發生，提示iPSCs移植后可改善心肌梗死小鼠心功能。

由Cx-43構成的縫隙連接通道的主要作用是形成細胞間快速的電沖動，以保證心臟整體電活動的同步性和協調性，心臟正常的電活動取決于Cx-43的正常表達與分布，而一旦其表達與分布發生異常，即Cx-43發生重構，必然會引起CM的電耦聯障礙，導致室性心律失常發生。目前iPSCs移植后能否與宿主細胞形成一個有收縮功能的相對電獨立體系，尚缺乏系統觀察，移植細胞與宿主心肌是否能夠產生縫隙連接目前也尚無相關報道。而本實驗初步證實了iPSCs移植后可使小鼠心肌梗死區Cx-43的表達增加。

本研究僅從血壓、心率、心電圖ST段變化及Cx-43的表達方面探討了iPSCs移植對心肌梗死小鼠的心臟保護作用，并未探討iPSCs移植的最佳時間窗，細胞移植是否像血運重建一樣，越早越好？還是選在心肌梗死后炎癥反應劇烈時，有利于干細胞歸巢？或是選在心肌梗死后炎癥病理反應消退時？并未探討不同干細胞移植方法對實驗結果的影響。所有這些問題有待進一步研究。