硫化氫對長期過量飲酒小鼠心肌纖維化及miR-221表達的影響

肖 婷 宋宗仁 劉鴻濤 郭亞芹 張 樂 王 芳 楊 軍

(深圳市龍華區(qū)中心醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣東 深圳 518110)

心肌在長期過量飲酒情況下，可出現(xiàn)許多的病理改變，心肌纖維化是其中重要的病理改變之一〔1〕。而心肌纖維化常常是導(dǎo)致許多心血管疾病發(fā)生心律失常和發(fā)展為心力衰竭的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。微小RNA(miRNA)是一類長度20～25個核苷酸大小、機體內(nèi)源性表達的單鏈非編碼RNA分子，具有負向調(diào)節(jié)基因表達的功能。miRNAs通過與靶mRNA的3′-非編碼區(qū)特定序列互補配對，引起翻譯抑制或結(jié)合后降解，進而對基因表達進行轉(zhuǎn)錄后負向調(diào)控。基于此生物學(xué)功能，其參與了調(diào)控機體許多重要的生物學(xué)過程，如細胞增殖、分化、衰老及癌變〔2～4〕。有證據(jù)表明，miRNAs可通過調(diào)控靶基因的表達，參與調(diào)控心肌纖維化過程〔5〕。研究證實，硫化氫(H2S)在心血管系統(tǒng)中具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，可在多種心肌損傷模型中發(fā)揮心肌保護作用〔6〕。有研究還顯示H2S可改善長期攝入酒精導(dǎo)致的左室重構(gòu)〔7〕。本研究旨在探討H2S對酒精性心肌纖維化的影響及其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物、藥品與試劑 44只健康雄性昆明小鼠，體重16～21 g，由南華大學(xué)實驗動物中心提供。硫氫化鈉(NaHS)和DL-炔丙基甘氨酸(PAG)由 Sigma公司提供。Trizol試劑由Invitrogen公司提供。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒由Fermentas公司提供。

1.2方法

1.2.1分組、模型建立及干預(yù)方案 44只小鼠隨機分為4組：對照組、模型組、NaHS組和PAG組，其中對照組與模型組每組各10只，NaHS組與PAG組每組各12只。實驗前在實驗室適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w，使小鼠適應(yīng)環(huán)境。模型組、NaHS組及PAG組小鼠經(jīng)連續(xù)12 w每日自由飲用4%(V/V)的乙醇水溶液(4%的乙醇水溶液是唯一飲用水源)制作酒精性心肌纖維化模型〔8〕，對照組予以每日自由飲用清潔水。造模開始的同時，NaHS組給予每天腹腔注射NaHS溶液(50 μmol/kg)，PAG組給予每天腹腔注射PAG溶液(40 mg/kg)。對照組與模型組給予每天腹腔注射等體積生理鹽水。

1.2.2標本采集 造模第12 w末時，采用腹腔注射水合氯醛對小鼠進行麻醉，固定小鼠，打開胸腔，快速取出心臟，去除心包膜、血管等其他組織，用冰生理鹽水沖洗干凈，濾紙弄干。取左室部分心肌迅速放入4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋切片，用于行VG染色和Ⅰ型膠原免疫組化。取部分左室心肌組織凍存于-80℃冰箱，用于實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測。

1.2.3VG染色觀察心肌膠原沉積 取4%多聚甲醛固定后的心肌組織，行常規(guī)梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟、石蠟包埋后，制備組織切片，切片厚度約4 μm，然后進行VG染色，間質(zhì)膠原纖維呈紅色，于光鏡下觀察。

1.2.4免疫組化檢測心肌組織Ⅰ型膠原表達 石蠟包埋4%多聚甲醛固定的心肌組織，制備組織切片。切片常規(guī)脫蠟和水化，3%過氧化氫(H2O2)處理，抗原修復(fù)。以正常山羊血清封閉，滴加稀釋一抗Ⅰ型膠原抗體(1∶100)，37℃孵育90 min。磷酸鹽緩沖溶液(PBS)漂洗，滴加二抗，37℃孵育15 min，PBS漂洗，顯色劑顯色。然后以蘇木素復(fù)染，脫水、透明，封片，鏡檢。最后在顯微鏡下進行觀察，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕色定位明確的顆粒物質(zhì)為陽性細胞表達。

1.2.5RT-qPCR檢測miR-221的表達 取-80℃凍存的心肌組織，按照Trizol試劑說明提取心肌組織總RNA，紫外分光光度計檢測RNA的純度和濃度。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Fermentas公司，按照說明轉(zhuǎn)錄得到cDNA。選用U6為內(nèi)參。引物序列(5′-3′)如下：U6：GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT；mir-221：ACCTGGCATACAATGTAGATTTC。PCR反應(yīng)體系如下：Template(反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物)1 μl，引物A (10 μmol/L)0.5 μl，引物B(10 mol/L)0.5 μl，PCR H2O 13 μl，2×SYBR Green PCR混合物15 μl 。PCR擴增程序：95℃預(yù)變性10 min,隨后進入循環(huán)，95℃變性5 s,60℃退火延伸30 s,進行40個循環(huán)。數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法分析。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS18.0 軟件進行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1心肌組織VG染色結(jié)果 模型組心肌組織中紅染的膠原纖維較對照組明顯增多，即心肌纖維化加重。NaHS組心肌組織中紅染的膠原纖維較模型組明顯減少，即心肌纖維化減輕。PAG組與模型組相比，紅染膠原纖維進一步增多，心肌纖維化更為明顯。見圖1。

2.2Ⅰ型膠原蛋白免疫組化結(jié)果 模型組心肌組織中棕黃色陽性物質(zhì)顯著多于對照組，即模型組Ⅰ型膠原蛋白表達顯著高于對照組。NaHS組棕黃色陽性物質(zhì)較模型組顯著減少，即NaHS組Ⅰ型膠原蛋白表達較模型組顯著降低。相反，PAG組與模型組相比，棕黃色陽性物質(zhì)進一步明顯增多，即Ⅰ型膠原蛋白表達進一步顯著升高。見圖2。

圖1 各組心肌組織VG染色結(jié)果(×100)

圖2 各組心肌組織Ⅰ型膠原的表達(DAB，×400)

2.3各組心肌組織miR-221表達水平比較 模型組心肌組織中miR-221表達水平(1.67±0.12)顯著高于對照組(1.00±0.05，P<0.05)，NaHS組心肌組織中miR-221的表達水平(1.28±0.03)較模型組顯著下降(P<0.05)，PAG組(2.12±0.12)與模型組相比，miR-221表達水平進一步明顯增高(P<0.05)。

3 討 論

研究證實長期大量飲酒可導(dǎo)致出現(xiàn)以心臟擴大、肌纖維結(jié)構(gòu)紊亂、收縮功能下降為特征的心肌重構(gòu)〔9,10〕。同時，心肌纖維化也是慢性酒精性心肌損傷發(fā)生的一個重要環(huán)節(jié)。過量攝入酒精可使心肌細胞受損，從而繼發(fā)心肌成纖維細胞增殖和基質(zhì)膠原纖維蛋白分泌的增加，形成心肌纖維化〔11〕。本實驗結(jié)果同樣證實了長期過量飲酒可導(dǎo)致心肌纖維化發(fā)生。

H2S是近年來發(fā)現(xiàn)的一種小分子氣體遞質(zhì)，可以自由滲入細胞膜發(fā)揮生物效應(yīng)。在哺乳動物體內(nèi)，H2S可通過酶促反應(yīng)途徑產(chǎn)生，由磷酸吡哆醛-5′-磷酸依賴酶，主要為胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)和胱硫醚-β-合成酶(CBS)，催化底物L-半胱氨酸而成。其中CBS主要高表達于腦組織中，而CSE 主要存在心血管組織中。H2S在心血管系統(tǒng)中具有重要的調(diào)節(jié)功能，參與調(diào)控許多心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過程。Mani等〔12〕發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性H2S可通過抑制血管內(nèi)膜的增殖和黏附分子的表達保護血管免受粥樣硬化損傷，而減少內(nèi)源性H2S生成可加速血管動脈粥樣硬化的發(fā)展。Zhou等〔13〕在鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的糖尿病心肌病模型中發(fā)現(xiàn)，H2S可通過抗炎、抗氧化應(yīng)激及抗細胞凋亡等機制減慢糖尿病心肌病的發(fā)展。本研究結(jié)果提示H2S可有效減輕酒精性心肌纖維化。

有研究發(fā)現(xiàn)miRNAs參與高血壓、心肌缺血、心肌梗死、心力衰竭、心肌病等多種心血管疾病的心肌纖維化過程，具體機制為直接抑制多種細胞外基質(zhì)蛋白的表達或參與調(diào)控多條與心肌纖維化相關(guān)的信號通路〔14〕。miR-221是一種廣泛存在于各種組織中的miRNA。蘇明〔15〕通過構(gòu)建心肌特異miR-221轉(zhuǎn)基因小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠在大約1月齡時心臟明顯擴大，心臟重量指數(shù)明顯增大，心肌纖維化程度顯著增加。而其具體機制與miR-221調(diào)控p27/CDK2/雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路介導(dǎo)的自噬有關(guān)。長期過量飲酒在引起小鼠心肌纖維化的同時，可以上調(diào)miR-221的表達，這提示miR-221可能參與了酒精性心肌纖維化的發(fā)展過程。而H2S在減輕酒精性心肌纖維化的同時可下調(diào)miR-221的表達，這提示下調(diào)miR-221的表達可能是H2S減輕酒精性心肌纖維化的重要內(nèi)在機制。

綜上所述，我們初步認為H2S具有改善長期過量飲酒導(dǎo)致的心肌纖維化的作用，其內(nèi)在機制可能與H2S下調(diào)miR-221的表達有關(guān)，而其詳細的機制有待進一步研究。