益氣活血方動員骨髓干細胞對心肌缺血再灌注損傷大鼠JAK2-PI3K信號轉導調節的動態影響

李鑫輝 黃政德 黃淼鑫 杜建芳 李雅婧 許福麗 肖 青 郭晨鶴 徐瑪麗

(湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208)

心肌缺血再灌注損傷(IRI)是目前治療心肌缺血及預后所面臨的主要難題之一，如何有效預防和治療心肌IRI是近年臨床和科研的研究熱點，有研究證明凋亡在IRI中起主導作用〔1〕。目前運用干細胞技術治療IRI研究主要包括干細胞移植技術和干細胞動員技術〔2〕，前者繁瑣，需要分離培養、移植等，而經動員后的骨髓干細胞可自行歸巢于缺血區，并分化為內皮細胞及心肌細胞，相對簡單，無創傷性，因而受到關注。有研究表明中藥可以影響干細胞的動員、歸巢，對干細胞治療缺血性心肌病起到優勢互補、協同增效的作用〔3,4〕。本研究探討益氣活血方動員骨髓干細胞對心肌IRI大鼠JAK2-PI3K信號轉導調節的動態影響。

1 材料與方法

1.1動物、主要試劑及儀器 SD大鼠144只，體重200～250 g。由湖南中醫藥大學實驗動物中心提供，許可證號為SCXK(湘)2009-0001。JAK2，一抗，武漢博士德公司；PI3K，一抗，武漢博士德公司；多道生理信號采集處理系統，RM-6280型，成都儀器廠制造；島津分光光度計，UV-1700 PharmaSpec型，Japan；顯微攝像系統，Motic B5型，麥克奧迪實業集團公司；益氣活血方藥(紅花5 g，生地15 g，黃芪25 g，丹參20 g，檀香5 g，赤芍10 g，川芎10 g，當歸10 g等)，由湖南中醫藥大學第一附屬醫院藥房提供并經過浸泡，去渣，水煎濃縮至藥液濃度1 g/ml(含生藥)，保存備用。

1.2方法

1.2.1造模方法 大鼠用10%水合氯醛麻醉后開胸，找到位于左心耳和肺動脈圓錐間與左冠狀動脈伴行的冠狀靜脈，并以此靜脈為標志進行結扎當心電圖呈現ST段、T波進行性抬高，為心肌缺血的標志。以ST段下移，缺血部位心肌顏色恢復為血流再灌注成功。

1.2.2動物分組及給藥方法 大鼠144只隨機分組，于造模后3個不同時間段觀察，A：假手術組；B：IRI組；C：重組人促紅細胞生成素(rhEPO)動員組；D:益氣活血方組；E:益氣活血方聯合動員組;F:LY294002組(益氣活血方聯合動員+PI3K的特異性阻斷劑組)，每組8只。A組只穿線不結扎，其余各組行IRI手術，結扎冠脈30 min后恢復血流；C、E和F組在腹腔注射rhEPO(2 000 U/kg)，每天1次，連續3 d(即造模前1 d、造模當天、造模后1 d)，A、B和D組注射等劑量生理鹽水；F組在結扎前30 min，尾靜脈注射PI3K的阻斷劑LY294002(0.3 mg/kg)。按人(60 kg)與動物體表面積折算劑量給藥，D、E和F組，灌胃益氣活血方藥10 ml·kg-1·d-1〔相當于生藥含量10 g·kg-1·d-1〕5 d(即造模前2 d、造模后3 d)，每天1次；A、B和C組灌胃等量0.9%NaCl溶液5 d，每天1次。

1.2.3心肌細胞JAK2、PI3K蛋白表達測定 在造模型后7 d，14 d，28 d將動物處死，取各組缺血心肌組織制作免疫組化病理切片(4 μm厚)，各組蛋白表達采用免疫組化法進行檢測，按試劑盒使用說明書操作。圖像分析：每張切片隨機在顯微鏡400倍下取5個視野，用彩色病理圖像分析系統進行測量平均光密度(OD值)。

1.2.4心肌細胞凋亡檢測 在造模型后28 d將動物處死取各組缺血心肌組織，4%多聚甲醛固定，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋并制成病理切片(4 μm厚)，采用TUNEL法檢測，按試劑盒說明書操作。

1.3統計學方法 采用SPSS19.0 統計軟件進行方差分析和非參數檢驗。

2 結 果

2.1益氣活血方動員骨髓干細胞對心肌IRI大鼠心肌細胞JAK2蛋白表達的影響 B組在各時間點JAK2蛋白表達與A組比較明顯降低(P<0.01)，而與B組比較，在各時間點C、D和E組JAK2蛋白表達明顯升高(P<0.01)；與C，D組比較，E組JAK2表達升高，但在7 d時無顯著差異，在14 d，28 d明顯升高(P<0.05，P<0.01)。F組較E組明顯降低，顯示益氣活血方聯合動員骨髓干細胞可以明顯提高JAK2蛋白表達，且時間越久作用越明顯。見表1，圖1。

表1 各組心肌JAK2蛋白表達

與A組比較：1)P<0.01；與B組比較：2)P<0.01；與E組比較：3)P<0.05，4)P<0.01；下表同

圖1 7 d、14 d各組心肌JAK2蛋白表達免疫組化觀察(DAB，×400)

2.2益氣活血方動員骨髓干細胞對心肌IRI大鼠心肌細胞PI3K蛋白表達的影響 B組在各時間點PI3K蛋白表達與A組比較明顯降低(P<0.01)。與B組比較，在各時間點C、D和E組PI3K蛋白表達明顯升高(P<0.05，P<0.01)；與C，D組比較，E組在各時間點PI3K表達明顯升高(P<0.05，P<0.01)。F組較E組明顯降低，顯示益氣活血方聯合動員骨髓干細胞可以明顯提高PI3K蛋白表達，且隨著時間推移提高PI3K蛋白表達作用越明顯。見表2，圖3。

2.3益氣活血方動員骨髓干細胞對心肌IRI大鼠心肌細胞凋亡的影響 28d時結果顯示，B組〔(60.87±4.55)%〕與A組比較明顯升高〔(29.25±2.96)%，P<0.01〕，且與B組比較，C〔(45.62±2.00)%〕、D〔(42.50±2.00)%〕和E組〔(35.37±1.92)%〕心肌細胞凋亡明顯降低(P<0.01)，而與C，D組比較，E組心肌細胞凋亡明顯降低(P<0.01，P<0.05)。F組〔(39.12±1.42)%〕較E組心肌細胞凋亡明顯升高，顯示益氣活血方聯合動員骨髓干細胞可以明顯減低心肌細胞凋亡作用。見圖4。

表2 各組心肌PI3K蛋白表達

圖2 28 d各組心肌JAK2蛋白表達免疫組化觀察(DAB，×400)

圖3 各組心肌PI3K蛋白表達免疫組化觀察(DAB，×400)

圖4 28 d各組心肌細胞凋亡觀察(TUNEL,×400)

3 討 論

干細胞動員劑可顯著增高外周血干細胞水平進而促進骨髓干細胞向缺血組織歸巢，在心肌微環境作用下分化為心肌細胞，改善因缺血缺氧環境誘導的細胞凋亡和有效收縮單位減少〔5〕。研究表明，活化的PI3K能使下游信號蛋白絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(Akt)發生磷酸化，進而介導細胞的增殖、遷移、分化和存活〔6〕，同時PI3K/Akt信號通路在胚胎干細胞向心肌細胞分化方面起著重要作用〔7〕，具有抗凋亡、促細胞存活等功能。JAK是一類非受體酪氨酸激酶家族，JAK的底物為信號轉導子和轉錄激活子(STAT)，STAT可被JAK磷酸化后發生二聚化，發揮生物學效應〔8〕。研究表明JAK/STAT途徑對心肌IRI起著重要作用〔9，10〕，Hwang等〔11〕研究醛糖還原酶過量表達，可以激活JAK/STAT途徑，減輕心肌缺血再灌注損傷，而劉勝中等〔12〕則發現JAK2/STAT3信號途徑可以減輕細胞凋亡從而保護心肌。促紅細胞生成素(EPO)可以抗凋亡、抗炎，促進心肌細胞增殖，促進微血管生成〔13〕，同時EPO顯著增強血管內皮祖細胞的動員〔14〕。Kilic等〔15〕研究發現EPO可以激活Jak/Stat，PI3k/Akt信號途徑，進而發揮抗氧化、抗凋亡作用，保護缺血心肌。

中醫學認為，心肌IRI其病位在心，涉及血脈，辨證多屬氣虛血瘀，本虛標實。益氣活血方是由丹參飲加味而來，應用中醫“氣行則血行”的理論，用黃芪補氣培元，扶助心氣；重用丹參活血化瘀入血分；檀香善入氣分；生地黃、當歸補虛養血治本。全方補氣活血，通絡止痛。我們前期研究〔16，17〕表明益氣活血方可以提高CD34+蛋白表達，促進骨髓干細胞動員，同時可以升高Bax蛋白表達。本研究結果顯示，且益氣活血方可以顯著動員自身骨髓干細胞，從而增加血液中干細胞數量，然后促進干細胞歸巢和提高干細胞定向分化數量并激活JAK2/STAT3和PI3/AKT信號途徑，進一步通過激活或抑制其下游靶蛋白，減少細胞凋亡。

綜上所述，益氣活血方與動員骨髓干細胞相結合治療心肌IRI具有協同增效、優勢互補作用，其機制之一可能是益氣活血方直接抑制心肌細胞凋亡或動員骨髓干細胞，影響其歸巢，促進干細胞定向分化，與調節JAK2-PI3K信號轉導，從而有抑制心肌細胞凋亡有關。