錦雞兒總黃酮對大鼠腦缺血再灌注損傷后半暗帶區GFAP表達的影響

何前松 張亞洲 翁 檸 樊梓媛 胡斐然 馮 泳

(貴陽中醫學院，貴州 貴陽 550001)

缺血性腦卒中是臨床上最為常見的腦血管疾病之一，其發病率高、致殘率高、致死率高、復發率高〔1〕。挽救、保護缺血半暗帶區(缺血灶邊緣區)可逆的神經元細胞是治療缺血性腦卒中的關鍵環節。缺血性腦卒中屬于中醫中風病，運用中醫藥防治中風病的歷史悠久。錦雞兒根(又名金雀花根、板參、陽雀花根、土黃芪)，具有活血祛風、補氣益腎之功，其主要藥效成分是錦雞兒總黃酮(TFC)，目前研究發現，錦雞兒總黃酮對腦缺血損傷有保護作用，可提高腦缺血損傷模型大鼠腦組織超氧化物歧化酶(SOD)活性，降低丙二醛(MDA)含量；抑制血液黏度升高，降低血小板聚集，改善紅細胞變形能力〔2，3〕。研究證實錦雞兒根提取物具有顯著抗缺血缺氧、抗運動疲勞等作用〔4，5〕，對腦微血管內皮細胞有保護作用〔6〕，但其作用機制尚不清楚。近年來，有研究發現神經發生在腦缺血后腦組織修復和神經功能恢復中發揮重要作用〔7〕。本實驗觀察了腦缺血后缺血周邊區星形膠質細胞膠質纖維酸性蛋白(GFAP)生長變化，TFC對大鼠腦缺血后神經功能恢復和神經發生的影響及機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物及藥品 雄性Wistar大鼠購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號： SCXK(京)2012-0001，體重(280±20)g。分籠飼養，自由飲水，飼養溫度為22～25℃，相對濕度40%～60%。藥品：取適量錦雞兒根提取總黃酮類化合物，采用紫外分光光度法檢測蘆丁含量達70.3%。

1.2試劑及儀器 免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋公司；兔抗GFAP多克隆抗體(美國，Santa Cruz)；5%BSA封閉液，TRITC 熒光二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司；數控抗原熱修復儀(廣州深達生物制品技術有限公司)；切片機(LEICA，RM2135)；倒置熒光顯微鏡(德國LEICA公司)；凝膠成像系統(美國Bio-rad公司)；轉膜儀(美國Bio-rad公司)；電泳儀(美國Bio-rad公司)。

1.3實驗分組及給藥方法 取60 只大鼠，隨機分為：假手術組、模型組、TFC高、中、低劑量組每組12只，TFC高、中、低劑量組于腦缺血1.5 h再灌注3 h后，分別給予TFC(60 mg/kg、30 mg/kg、15 mg/kg)灌胃，假手術組及模型組給予等體積生理鹽水，每日1次，連續治療14 d。

1.4腦缺血模型的制作 用3.5%異氟烷和30%氧氣混合氣體將大鼠麻醉，固定，面罩持續吸入3.5%異氟烷和30%氧氣混合氣體維持麻醉。參照文獻線栓法〔8〕制作大鼠腦缺血再灌注模型。在整個實驗過程中使用恒溫電熱板維持大鼠體溫在(37.0±0.5)℃。

1.5神經功能缺損評分 參照文獻方法〔9〕評價大鼠腦缺血神經功能缺損。評分標準：無神經功能缺損癥狀者0分；有輕度神經功能缺損，表現為不能完全伸展左側前爪者1分；有中度局灶性神經功能缺損，表現為向左側轉圈者2分；有重度局灶性神經功能缺損，表現為向左側傾倒者3分；不能自發行走，表現有意識水平下降者4分。2～4分者入選，觀察大鼠腦缺血后24 h和治療第14天后神經功能缺損評分。

1.6HE染色觀察大鼠缺血周邊區腦組織形態結構 大鼠腦缺血治療14 d，末次給藥后2 h用水合氯醛(0.3 ml/100 g體重,腹腔注射) 將大鼠麻醉，剖開胸腔，暴露心臟，經左心室向升主動脈插管，剪開右心耳，用預冷的生理鹽水速灌沖洗，直至流出液體變清為止；再用預冷的4%多聚甲醛( 0.1 mol/L PBS 配制，pH值7.4)100 ml緩慢灌注固定；取出腦組織，放于4%多聚甲醛中固定48 h。取出腦組織脫水、常規石蠟包埋、切片，HE染色，在光鏡下觀察缺血周邊區腦組織形態結構。

1.7免疫熒光法觀察缺血周邊區GFAP表達 免疫熒光組織化學染色檢測大鼠缺血半暗帶區GFAP的表達。取上述腦片，GFAP多克隆抗體(1∶200)，TRITC 熒光二抗，5%BSA封閉液，孵育，4℃過夜。應用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件在400 倍視野下選取相應區域3 個不重疊視野檢測陽性染色部位的積分光密度(IOD) 值。按平均IOD=IOD/面積計算，實驗重復6次取其平均值表示GFAP的相對表達量(n=6)。

1.8Western印跡檢測大鼠缺血半暗帶區GFAP蛋白表達 取缺血半暗帶區腦組織100 mg，加入蛋白裂解液，勻漿，4℃ 12 000 r/min，10 min，取上清，用BCA試劑盒進行蛋白定量后調整樣品濃度。取50 μg蛋白樣品上樣，進行電泳(濃縮膠恒壓80 V，約40 min；分離膠恒壓120 V，電泳至溴酚藍到凝膠底部)、轉膜(恒流300 mA，冰浴轉膜2 h)、封閉(TBST溶解的5%脫脂奶粉，pH7.5)中室溫輕搖90 min，加入GFAP一抗(內參用β-Actin 1∶1 000)孵育，4℃冰箱過夜。洗膜，加入羊抗兔-HRP 1∶10 000二抗，室溫孵育60 min。洗膜、ECl反應、曝光、顯影、定影，凝膠圖像處理系統分析結果。

1.9統計學處理 采用SPSS22.0軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1各組神經功能缺損評分比較 大鼠腦缺血24 h后表現出明顯的神經功能缺損癥狀，TFC高、中、低劑量組與模型組比較差異無統計學意義(P>0.05)。治療14 d后，與模型組比較，TFC高、中、低劑量組神經功能缺損評分均顯著降低(P<0.05，P<0.01)。見表1。

表1 各組腦缺血神經功能缺損評分比較

與模型組治療后14 d比較：1)P<0.05,2)P<0.01

2.2各組缺血半暗帶區腦組織形態學變化比較 假手術組神經細胞排列有序，未見水腫，胞體、核仁、核膜清晰。模型組缺血中心區范圍明確，可見間質內大小不等的空泡，有散在神經細胞，細胞界限不清。TFC高、中、低劑量組腦組織可見缺血中心區減小，缺血周邊區可見部分神經細胞、胞質、胞核尚能分清，有細胞脫失，結構完整的神經元數量較多，變性壞死組織范圍相對較小、程度較輕。見圖1。

2.3各組缺血周邊區腦組織GFAP表達陽性細胞數比較 治療14 d后，與假手術組(13.33±5.27)相比，模型組(390.16±78.64)和TFC高(294.68±65.82)、中(356.67±45.20)、低劑量(372.83±41.16)組缺血周邊區腦組織GFAP陽性細胞數明顯增多(P<0.01)；與模型組比較，TFC高、中劑量組大鼠缺血周邊區腦組織GFAP陽性細胞數明顯減少(P<0.05，P<0.01)，且細胞生長形態規則。見圖2。

2.4各組缺血周邊區腦組織GFAP蛋白表達水平比較 與假手術組(0.59±0.12)比較，模型組(1.71±0.13)和TFC高(1.27±0.16)、中(1.58±0.15)、低劑量(1.62±0.14)組缺血周邊區腦組織GFAP蛋白表達量顯著升高(P<0.01)；TFC高、中劑量組大鼠缺血周邊區腦組織GFAP蛋白表達量與模型組相比明顯減少(P<0.05，P<0.01)。見圖3。

圖1 各組缺血半暗帶區腦組織形態學(×200)

圖2 腦缺血14 d各組缺血半暗帶區GFAP表達陽性細胞數(×200)

圖3 腦缺血14 d各組缺血半暗帶區GFAP蛋白表達

3 討 論

腦缺血致殘的病機主要是急性腦血管閉塞引起的腦缺血，腦缺血后造成神經組織壞死和凋亡，進一步造成神經功能障礙。有研究認為腦梗死后缺血半暗帶區腦組織損傷可能逆轉〔10〕。然而，GFAP是腦內數量最多、分布最廣的一種神經細胞，是中樞神經系統的主要組成部分，參與多種生理反應。GFAP是星形膠質細胞的標志蛋白〔11〕。已有研究證實，在生理條件下，星形膠質細胞在維持神經細胞外微環境穩定中起重要作用〔12〕；在腦缺血后，星形膠質細胞出現反應性增生，數量增多，并且活化的星形膠質細胞能清除興奮性谷氨酸，調節細胞代謝，維持血腦屏障結構，產生和釋放神經營養因子〔13～15〕。此外，星形膠質細胞的過度生長可形成膠質瘢痕，影響神經功能恢復〔16〕。也有報道，GFAP 在腦損傷后表達均增強，過度表達的星形膠質細胞可填充局部損傷的組織缺損，形成的屏障阻礙神經組織再生與功能重建，是影響神經再生與功能恢復的重要原因之一〔17〕。有研究表明，通過抑制GFAP基因表達，可抑制星形膠質細胞生長和膠質瘢痕的形成，從而促進神經功能恢復〔18，19〕。有研究表明，采用反義GFAP mRNA技術阻止GFAP合成，可減少星形膠質細胞肥大，能緩解損傷后因GFAP過度生長影響神經元軸突生長〔20〕。由此可見，通過調節GFAP表達，抑制星形膠質細胞的過度增生，可防止膠質瘢痕形成，從而促進損傷腦組織修復和神經功能恢復。

本研究結果顯示，TFC可改善腦缺血大鼠神經功能恢復，能促進損傷神經細胞修復，TFC既可促進星形膠質細胞生長，又可抑制膠質瘢痕的形成，有利于促進損傷腦組織修復和神經功能恢復。