決明子多糖對大鼠青光眼視網(wǎng)膜細胞的保護作用及機制

張 新 趙 燕 魏 玲

(河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院眼科，河北 石家莊 050031)

青光眼致盲率位居眼科疾病的第二位，僅次于白內(nèi)障〔1〕。老年性青光眼在老年人中極其常見，且隨增齡發(fā)病率增高〔2〕。青光眼的發(fā)病與多種因素有關(guān)，其中視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細胞扮演著重要的角色。小膠質(zhì)細胞在青光眼發(fā)病早期出現(xiàn)增殖和阿米巴樣變化，同時伴隨大量的前炎癥因子如腫瘤壞死因子(TNF)-α及白細胞介素(IL)-1β增加，這些炎癥因子會進一步誘發(fā)視網(wǎng)膜的損害〔3，4〕。目前治療青光眼主要通過手術(shù)及降壓藥對癥治療，雖然眼內(nèi)壓降低，但視力功能仍然發(fā)生進一步的損害，加強手術(shù)后對視網(wǎng)膜細胞的保護能夠有效緩解疾病。決明子具有清肝明目、潤腸通便的作用。現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實了決明子具有多種作用，包括降血脂、降血壓、抗氧化等，已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、飲食保健等多個領(lǐng)域〔5～7〕。決明子多糖是決明子的主要有效成分之一。本實驗擬探討決明子多糖對青光眼大鼠視網(wǎng)膜病變及視網(wǎng)膜細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1動物與細胞 BV2小膠質(zhì)細胞，購于國家實驗細胞共享平臺。SD大鼠，雌雄各半，SPF級，60只，體質(zhì)量230～270 g。購自河北省實驗動物中心，許可證號為 SCXK(冀) 2009-0022。光照和黑暗時間各12 h，濕度50%～70%，自由飲食和飲水。

1.2主要試劑與儀器 胰蛋白酶(Gibco)；胎牛血清(Hyclone)；DMEM(Hyclone)；青鏈雙抗(Hyclone)；脂多糖(LPS，Sigma)；DMSO(碧云天)；氯仿(北京化工廠)；異丙醇(北京化工廠)；逆轉(zhuǎn)錄及Q-PCR試劑盒(寶生物工程公司)；Trizol Reagent(Life technology)；TUNEL試劑盒(Promega)；二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo Scientific)；倒置顯微鏡(Olympus)；超純水機(Millipore)；酶標儀(Thermo)；熒光定量PCR儀(伯樂)；高速低溫離心機(Eppendorf)；萬分之一天平(梅特勒)。

1.3藥物配置 決明子多糖購于蘭州沃特萊斯生物科技有限公司。細胞實驗：決明子多糖使用含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)液配置成2 g/L的母液，使用時配置成15，30和60 mg/L的工作液。動物實驗，決明子多糖使用蒸餾水配置成25，50和100 mg/ml，按照2 ml/100 g體重灌胃大鼠。

1.4小膠質(zhì)細胞培養(yǎng) 使用含有10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基進行BV2小膠質(zhì)細胞的培養(yǎng)，另外添加1%的青鏈雙抗以防止細胞污染。細胞復(fù)蘇時取出凍存的BV2細胞，于37℃條件下迅速解凍后接種于3.5 mm培養(yǎng)皿，培養(yǎng)36 h。待細胞基本長滿培養(yǎng)皿后，使用0.25%胰蛋白酶消化細胞，150 g，3 min離心收集細胞，新鮮培養(yǎng)液重懸后傳代。凍存細胞使用含有15%DMSO的細胞培養(yǎng)液，如上述使用胰蛋白酶消化細胞離心收集后，使用凍存細胞液重懸BV2細胞，并置于梯度凍存盒內(nèi)，24 h后轉(zhuǎn)移至液氮中凍存。

1.5小膠質(zhì)細胞阿米巴原化實驗 體外培養(yǎng)BV2小膠質(zhì)細胞，分為對照組，LPS組，決明子多糖低、中和高劑量組，每組6孔于96孔板內(nèi)進行實驗。決明子多糖低、中和高劑量組分別加入不同濃度的決明子多糖，使其終濃度分別為15，30和60 mg/L，共孵育12 h。孵育完成后，除對照組外，其余各組均加入LPS使其終濃度為1 mg/L。孵育12 h后使用冷丙酮固定，送本院病理科使用蘇木精染色。倒置顯微鏡觀察細胞阿米巴樣變化，6個樣品孔，每孔計數(shù)50個細胞，記錄阿米巴原化的細胞數(shù)量。

1.6小膠質(zhì)細胞TNF-α及IL-1β基因表達實驗 如1.5所述分別加入決明子多糖及LPS刺激細胞，孵育完成后使用PBS沖洗細胞，并加入Trizol裂解細胞，按照Trizol試劑盒說明書方法提取RNA。使用寶生物逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用儀器自帶程序按2-△△Ct法計算TNF-α及IL-1β基因表達量。TNF-α引物為5′-GAAAGCAAGCAGCCAACCA-3′及5′-CGGATCATGCTTTCTGTGCTC-3′。IL-1β引物為5′-AATGACCTGTTCTTTGAAGTTGA-3′及5′-TGATGTGCTGCTGCG AGATTTGAAG-3′；GAPDH內(nèi)參基因為5′-TTAGCACCCCTGGCCAAGG-3′及5′-CTTACTCCTTGGAGGCCAT G-3′。擴增條件為95℃，30 s，1個循環(huán);95℃，5 s，60℃，35 s，40個循環(huán)。

1.7青光眼大鼠造模 60只SD雄性大鼠，隨機分為對照組，模型組，決明子多糖低、中和高劑量組(500，1 000和2 000 mg/kg)，每組12只。 除對照組外，其余48只大鼠使用手術(shù)法造青光眼模型。大鼠使用10%水合氯醛麻醉后開眼瞼，使用精細剪剪開球結(jié)膜，暴露上直肌、下直肌，使用體視顯微鏡找到鞏膜上靜脈，并使用烙鐵針烙斷3條鞏膜上靜脈，以遠端上靜脈變白作為烙閉成功的指標。手術(shù)3 d后開始灌胃給藥，決明子多糖組給予相應(yīng)劑量的決明子多糖，對照和模型組給予等量蒸餾水，共灌胃3 w。

1.8大鼠眼內(nèi)壓測定 于術(shù)后第3日及3 w灌胃完成后上午8～10點測定大鼠眼內(nèi)壓變化。大鼠使用奧布卡因滴眼液麻醉，并使用Goldmann鼠用眼壓測定儀測定大鼠左眼眼內(nèi)壓。每只測定3次取均值。

1.9大鼠視網(wǎng)膜TUNEL及HE染色 灌胃給藥3 w后，大鼠使用乙醚過量麻醉處死，迅速分離大鼠左右眼，使用PBS溶液沖洗后，沿角膜剪開去除晶狀體及玻璃體，操作輕柔避免損傷視網(wǎng)膜。將剩余部分全部放入4%多聚甲醛中固定，送檢本院病理科制作切片，其中左眼于病理科HE染色并觀察視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)變化，右眼切片TUNEL染色觀察細胞凋亡情況。

1.10統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件，多組比較采用LSD法。

2 結(jié) 果

2.1決明子多糖對小膠質(zhì)細胞阿米巴原化的影響 如圖1所示，LPS組BV2小膠質(zhì)細胞出現(xiàn)明顯的阿米巴原化。對照組、LPS組、決明子多糖低、中和高劑量組的BV2小膠質(zhì)細胞阿米巴原化率分別為(0.0±0.0)%，(72.8±4.3)%，(51.2±6.5)%，(37.22±3.7)%，(23.9±2.8)%。與LPS組細胞阿米巴原化率相比，決明子多糖低(P<0.05)、中(P<0.01)和高劑量組BV2小膠質(zhì)細胞阿米巴原化率明顯降低(P<0.01)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 小膠質(zhì)細胞阿米巴樣變化(HE，×400)

2.2決明子多糖對小膠質(zhì)細胞TNF-α和IL-1β基因表達的影響 與對照組相比，LPS組TNF-α和IL-1β基因表達水平顯著上調(diào)(P<0.05或P<0.01)。與LPS組比較，決明子多糖低、中和高劑量組的TNF-α基因表達水平顯著性下調(diào)(P<0.05或P<0.01)；決明子多糖高劑量組的IL-1β水平顯著性下調(diào)(P<0.05)。見表1。

2.3決明子多糖對青光眼大鼠眼內(nèi)壓的影響 與對照組相比，模型組在造模3 d后及給藥3 w后左眼眼內(nèi)壓顯著性升高(P<0.01)。與模型組相比，決明子多糖低、中和高劑量組在造模3 d后及給藥3 w后左眼眼內(nèi)壓均無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表1 各組TNF-α和IL-1β的基因表達

與對照組比較：1)P<0.01，2)P<0.05；與LPS組比較：3)P<0.01，4)P<0.05；表2同

表2 各組大鼠眼內(nèi)壓

2.4決明子多糖對青光眼大鼠視網(wǎng)膜細胞凋亡的影響 與對照組〔(0.0±0.0)個〕相比，模型組視網(wǎng)膜凋亡細胞個數(shù)顯著性增加〔(11.2±1.5)個，P<0.01〕。與模型組大鼠相比，決明子多糖低、中和高劑量組視網(wǎng)膜凋亡細胞個數(shù)顯著性減少〔分別為(8.8±1.0)個，(8.3±1.6)個，(6.5±1.3)個；P<0.05〕。

2.5決明子多糖對青光眼大鼠視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)的影響 對照組視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)清晰，視網(wǎng)膜細胞排列整齊，可見細胞呈現(xiàn)三層分布。模型組視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)混亂，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞層和內(nèi)核層交錯混雜。決明子多糖低劑量組可見視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞層及內(nèi)核層，但神經(jīng)節(jié)細胞層有損傷。決明子中劑量組及高劑量組神經(jīng)節(jié)細胞層均未見明顯損傷。見圖2。

圖2 各組大鼠視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)圖(×200)

3 討 論

小膠質(zhì)細胞是介導(dǎo)神經(jīng)系統(tǒng)免疫應(yīng)答的效應(yīng)細胞，在對抗感染等應(yīng)激性疾病的過程中起著重要的作用〔8〕。在正常狀態(tài)下，小膠質(zhì)細胞可以及時清理機體內(nèi)衰老或壞死的神經(jīng)細胞。而在應(yīng)激狀態(tài)下，如青光眼或感染狀態(tài)，小膠質(zhì)細胞會迅速分化，發(fā)生阿米巴樣改變，成為免疫效應(yīng)細胞。在應(yīng)激狀態(tài)早期，小膠質(zhì)細胞分泌的前炎癥因子如TNF-α和IL-1β等能夠有效保護視網(wǎng)膜細胞。但隨著病程延長，小膠質(zhì)細胞引起的炎癥會損傷正常的視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞，從而加劇損傷〔9〕。決明子是豆科植物決明的干燥種子，以其清肝明目的作用而命名。《本草綱目》記載，決明子能夠除肝膽風(fēng)熱，淫膚白膜，青盲。現(xiàn)代藥理學(xué)研究亦證實了決明子具有明目的功效〔10〕。本實驗首次從體外及體內(nèi)兩個方面探討了決明子多糖對大鼠青光眼視網(wǎng)膜細胞的保護作用。證實了決明子能夠通過抑制小膠質(zhì)細胞阿米巴樣變化，從而抑制其炎癥因子的產(chǎn)生，起到保護青光眼大鼠視網(wǎng)膜細胞的作用。而在體實驗說明，決明子多糖保護視網(wǎng)膜細胞的作用與抑制視網(wǎng)膜細胞凋亡有關(guān)，但其直接降低眼內(nèi)壓的作用并不明顯。大鼠眼內(nèi)壓測定的誤差較大，本實驗采用同一大鼠測定3次的方法減小誤差以獲得準確的數(shù)據(jù)。