濱蒿內酯基于CAR調控CYP3A4轉錄表達的作用機制

畢紅東 馬安寧 劉 杰 郭娜娜 龐澤華 李寶群

(承德醫學院藥理教研室，河北 承德 067020)

CYP3A4為 CYP450超家族的成員，參與了50%以上臨床常用藥和膽紅素的代謝〔1〕。近年來發現核受體是調控CYP3A表達的關鍵因子；有研究證實結構性雄甾烷受體(CAR)可誘導CYP3A4的轉錄〔2〕，一些具有解毒保肝的中草藥(TCMs)都可影響藥物代謝酶表達〔3〕，但尚缺乏分子機制的研究。茵桅黃具有清熱解毒、利膽保肝等作用，臨床用于治療肝炎、黃疸等疾病〔4〕，濱蒿內酯是傳統中藥茵陳/茵陳蒿中的有效單體，而茵陳則為茵梔黃方劑的主要成分，研究發現〔5〕茵梔黃可通過核受體CAR誘導膽汁酸轉運體多藥耐藥相關蛋白(MRP)2，繼而證實其活性成分之一即為濱蒿內酯，本研究進一步闡明濱蒿內酯對CYP3A4表達的影響及機制。

1 材料與方法

1.1材料 人張氏(Chang Liver)細胞由本室自行凍存；rTaq酶購自TaKaRa公司；逆轉錄試劑盒/報告基因分析試劑盒購自Promega公司；編碼CAR及CYP3A4報告基因載體由中南大學臨床實驗室惠贈。濱蒿內酯二甲基亞砜(DMSO)溶解購自湖南省藥檢所。

1.2方法

1.2.1細胞培養與處理 37℃、5% CO2用DMEM+10%胎牛血清培養Chang Liver細胞，DMSO為溶媒對照，加入0.01、0.10和1.00 μmol/L濱蒿內酯孵育24、36、48 h后收集細胞，制備總RNA后合成第1鏈cDNA。正向引物ccccctgaaaatttgggccaaaga，反向引物taattttggggctcaaaggct；擴增條件94℃ 2 min；94℃ 30 s；42℃ 30 s；72℃ 30 s,30個循環,瓊脂糖凝膠電泳后以掃描灰度分析目的條帶信號強度。

1.2.2細胞轉染 轉染前24 h，按5×104細胞孔接種至96孔培養板，每組6孔，200 ng CYP3A4-promoter-Luc，50 ng hCARΔATG-pcDNA3.1B(-)，20 ng pRL-TK為內對照與0.5 μl陽離子脂質體混合孵育后4 h后更換為普通培養基繼續培養20 h后再次行藥物處理。

1.2.3報告基因檢測 細胞轉染后24 h棄去原培養基，加入0.01、0.10和1.00 μmol/L濱蒿內酯處理48 h后裂解細胞，同設DMSO溶媒對照組和含有10 μmol/L苯巴比妥-DMSO的陽性對照組，各組細胞處理用報告基因分析試劑盒測定熒光素酶活性值共重復3次。

1.3統計學分析 應用SPSS19.0軟件進行ANOVA分析和LSD方法。

2 結 果

2.1濱蒿內酯可影響CYP3A4轉錄表達 0.10和1.00 μmol/L濱蒿內酯處理細胞24 h和36 h后CYP3A4 表達增強(圖1)，與對照組差異有統計學意義(P<0.05)；而濱蒿內酯處理48 h后各濃度組都表現出抑制效應，CYP3A4 表達量降低且各濃度組與對照組差異有統計學意義(P<0.01)，見表1。

圖1 Chang Liver細胞中濱蒿內酯對CYP3A4 mRNA電泳結果

將包含CYP3A4啟動子的螢火蟲熒光素酶報告載體與hCAR真核表達載體共轉染Chang Liver細胞，并加入編碼海腎熒光素酶的pRL-TK載體作為內對照，苯巴比妥和各濃度濱蒿內酯孵育處理均可誘導CAR所驅動的CYP3A4的熒光素酶表達，與對照組差異有統計學意義(P<0.001)，見表2。

2.2濱蒿內酯對CYP3A4的誘導機制 細胞轉染后36 h，各濃度組細胞熒光素酶活性與對照組比較顯著增加，且CAR載體與空載體差異有統計學意義(P<0.001)，但不同濃度濱蒿內酯組差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

表1 CYP3A4經不同濱蒿內酯濃度和不同時間處理后的相對表達強度

與對照組比較：1)P<0.05；與0.01 μmol/L組比較：2)P<0.05

表2 不同濃度濱蒿內酯處理36 h對CAR質粒載體與CYP3A4表達載體的轉錄激活能力

與對照組比較：1)P<0.001；與空載體比較：2)P<0.001

3 討 論

臨床上出現黃疸主要是肝細胞對膽紅素攝取與排泄障礙的結果，以往利膽退黃藥物的機制研究多集中在膽紅素轉運體谷胱甘肽轉移酶(GST)A1上〔5〕，研究提示CYP450酶的活性顯著影響肝臟對膽紅素的攝取〔6〕。CYP3A4在人體中的表達存在30倍的差異〔1〕，CAR可介導苯巴比妥誘導多種CYP450酶的轉錄表達，也是膽紅素代謝中的主要調節因子，在CAR基因敲除鼠中同樣可見膽汁淤積造成的肝臟損害〔7〕；目前臨床治療黃疸的藥物有苯巴比妥、熊去氧膽酸等〔8〕。本實驗結果顯示濱蒿內酯對CYP3A4表達的誘導呈現時間依賴性和劑量依賴性，與陽性對照苯巴比妥的作用趨勢相似。然而作用48 h 后的抑制作用可能與濱蒿內酯抗腫瘤抑制細胞增殖作用有關。本研究結果還提示CYP450酶活性低下可能是黃疸疾病發生和發展的重要原因，對CYP450酶的誘導可能是濱蒿內酯等退黃藥物利膽退黃的作用基礎，因此，通過研究濱蒿內酯對CYP酶的作用可為開發和研制治療黃疸的新藥及提高和改善臨床上現有治療黃疸藥物的療效提供理論依據。