穴位貼敷對衰老大鼠Caspase-3和Caspase-8因子表達的影響

孫曉婷 李 魏 于 睿 張 歡 毛智慧 劉曉亭

(遼寧中醫藥大學，遼寧 沈陽 110847)

肌肉衰減綜合征由美國學者Rosenberg〔1〕于1997年首先提出，用以描述骨骼肌老化的進程，其質量及力量均呈顯著下降趨勢。2010年，老年肌肉衰減綜合征歐洲工作組(EWGSOP)的報告〔2〕，將肌肉衰減綜合征定義為，以老年人骨骼肌質量和骨骼肌力量及功能的降低為主要特征的退行性病征，主要強調肌肉質量和肌肉功能的下降。肌肉衰減綜合征的發生與衰老過程中線粒體介導的細胞凋亡信號通路的密切聯系應值得關注，而作為細胞凋亡的調控中心，線粒體可通過Caspase依賴性信號通路Caspase非依賴性信號通路介導細胞凋亡〔3〕。本實驗探討穴位貼敷療法對肌肉衰減綜合征大鼠Caspase-3和Caspase-8的影響。

1 材料與方法

1.1動物 雄性大鼠20只，清潔級，體重210～240 g，購自遼寧長生生物技術有限公司，許可證號SCXK-(遼)2015-0001。購入后于本學校實驗中心動物房IVC獨立送風飼養系統中在SPF條件下分籠飼養，以國家標準嚙齒類飼料喂養，自由飲食、飲水，溫度范圍21℃±2℃，相對濕度55%±5%。

1.2藥品、主要試劑及儀器 穴位貼敷的藥物由黃芪、黨參、茯苓、甘草、白芥子、細辛、姜汁等組成(沈陽遼河大藥房提供)，敷料為醫用無紡布膠帶(南昌市富達醫療器械有限公司)。D-半乳糖(美國Genview公司，批號5BN11010220)、氯化鈉注射液(遼寧民康制藥有限公司，批號H20054022)。Caspase-3試劑盒及Caspase-8試劑盒(天津市灝洋生物制品科技有限公司)。酶標儀〔賽默飛爾(上海)儀器有限公司〕，恒溫水浴箱(河北黃驊航天儀器廠)。

1.3方法

1.3.1膏藥制作方法與給藥 于穴位貼敷當天，將黃芪、黨參、茯苓、甘草、白芥子、細辛等藥物按比例研成粉末，過200目篩，加適量姜汁調勻至糊狀，制備成0.5 cm×0.5 cm大小的藥塊，用3 cm×3 cm大小的醫用無紡布膠帶固定于穴位貼敷組大鼠的雙側脾俞、雙側足三里穴位，再用一次性透氣孔膠帶纏繞一圈加以固定，對照組直接貼無紡布膠帶于雙側脾俞、雙側足三里，每次貼敷6 h，持續4 w。

1.3.2動物分組與模型制備 將20只SD大鼠隨機分為衰老模型組和穴位貼敷組(貼敷組)。參照文獻〔4〕的方法，每個大鼠按125 mg·kg-1·d-1的劑量，進行D-半乳糖腹腔注射，共6 w。

1.3.3動物取材及指標檢測 末次貼敷24 h后麻醉，取雙側股直肌，用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測量組織中Caspase-3和Caspase-8含量，測量過程嚴格按照試劑說明進行。

1.4統計學分析 采用SPSS17.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

貼敷組與衰老模型組Caspase-3和Caspase-8的表達差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 兩組Caspase-3和Caspase-8的比較

3 討 論

肌肉衰減綜合征是隨著年齡的增加出現的肌肉數量的減少及肌力的降低，主要表現為肌肉組織的萎縮、肌纖維束變窄、骨骼肌橫截面積減小、肌肉力量減退、肌肉代謝能力下降和脂肪組織增多等特征。骨骼肌力量的衰退，可使老年人的活動能力和平衡能力減弱，易發生跌倒，甚至導致老年人長期臥床。對于個人家庭來講，增加了老人自身的痛苦，也增加了其家人的經濟及精力的負擔。對于社會來講，增加了社會的醫療保健成本。因此，有效干預老年人的肌肉衰減綜合征的發生顯得尤為重要。肌肉衰減綜合征的病因病機復雜多樣，包括活動量不足、營養缺乏、肌肉衛星細胞的數量減少和功能減退、蛋白質營養素的缺乏、骨骼肌線粒體功能紊亂、激素水平變化、基因與種族等因素相關，目前尚無較完備的理論。但有研究證實，衰老過程中線粒體介導的細胞凋亡信號通路在肌肉衰減綜合征的發生與發展過程中發揮著重要的作用〔5〕。

中醫學認為脾主運化、主統血、主四肢肌肉，是“氣血生化之源”、“后天之本”。如果脾胃失健，便不能運化水谷精微至全身，就會出現肌肉萎縮、疲勞、肌耐力下降。從現代醫學角度來講，脾的功能與線粒體的功能在某種程度上是相似的，脾主肌肉亦是通過線粒體的功能來實現的〔6〕。線粒體是細胞中制造能量的結構，是細胞進行能量代謝的重要場所，具有“細胞的發電廠”之稱。線粒體通過氧化磷酸化和三羧酸循環、氧化體內三大營養物質(糖、蛋白質、脂肪)生成腺苷三磷酸(ATP)，從而為細胞各項生命活動供應能量，也為肌肉收縮提供能量。這與中醫中，脾能運化水谷精微、生化氣血、潤養肌肉的功能相一致。另一方面，線粒體迅速吸收Ca2+的能力使其成為細胞中Ca2+的緩沖區，線粒體可以儲存Ca2+，控制細胞中Ca2+濃度的動態平衡，進而維持細胞的功能及肌肉的正常功能狀態。線粒體這一功能也與中醫學的“脾主肌肉”極其相似。有研究發現，長期脾虛模型大鼠的心肌、肝、胃黏膜和骨骼肌細胞線粒體含量減少，體積縮小或腫脹，線粒體結構遭到破壞，基質改變，而四君子湯復健組，其線粒體含量增加，結構恢復也接近正常〔7〕，其實驗通過中醫健脾的方法，達到了改善線粒體的效果，從實踐上證實了脾與線粒體的相關性。

線粒體不僅是“細胞的發電廠”，而且在細胞凋亡的調控過程中起著重要的作用。根據目前的研究來看，線粒體參與細胞凋亡的途徑大致有三條，第一條途徑為線粒體通透性的改變，當線粒體通透性轉變孔(MPTP)過度開放時，可以導致跨膜電位消失，線粒體呼吸鏈斷裂，而且還會釋放出天冬氨酸特異性的Caspase家族激活因子〔8〕，從而激活Caspase，啟動細胞凋亡過程。Gao等〔9〕研究發現，MPTP持續開放時，出現了膜電位的降低，Caspase-3、-8、-9的活化，并且細胞凋亡增加。第二條途徑為線粒體膜電位(MMP)的改變，當MMP下降時，可導致細胞的凋亡，而MMP的降低與MPTP的持續開放有關〔10〕，同時又可以進一步導致MPTP的過度開放。第三條途徑線粒體膜磷脂的改變，心磷脂(CL)通過調節前凋亡因子從線粒體釋放到細胞質，進而開啟線粒體介導的細胞凋亡。Kagan等〔11〕的研究證實，在凋亡的過程中，CL的成分增加到了總量的40%。

在線粒體介導的細胞凋亡過程中，線粒體通透性的改變介導的Caspase依賴性細胞凋亡信號通路在肌肉衰減綜合征的發生發展過程中起著重要的調節作用，而在對Caspase依賴性的凋亡過程中，Caspase-3和Caspase-8又起著比較關鍵的作用。一方面，在該通路中細胞色素C(cytC)與凋亡蛋白酶活化因子(Apaf)-1和Caspase前體蛋白(procaspase)-9可形成凋亡小體。當MPTP過度開放時，可導致cytC的釋放，在脫氧腺苷三磷酸(dATP)存在的情況下，與Apaf-1和Procaspase-9相結合，形成凋亡小體，從而激活細胞凋亡啟動因子Caspase-9，隨后又激活細胞凋亡執行因子Caspase-3，繼而使細胞走向不可逆的凋亡〔12，13〕。李海鵬等〔14〕研究顯示，快速老化小鼠腓腸肌中Apaf-1和Caspase-3的表達均顯著上調，這說明衰老促進了凋亡信號在骨骼肌中的表達，從而導致骨骼肌細胞凋亡及肌肉衰減綜合征的發生。另一方面Caspase-8在Caspase級聯反應中處于核心地位，幾乎能激活所有凋亡級聯反應下游的Caspase而誘發凋亡〔15〕。Caspase-8主要定位于線粒體，其可以自我活化，同時也可以在顆粒酶B的剪切下活化，而Caspase-8的激活不但可以啟動細胞凋亡外途徑，還可以啟動細胞內途徑來導致細胞凋亡。Caspase-8活化后能引發Caspase蛋白酶的解級聯反應，然后進一步激活下游的Caspase-6、Caspase-7 等同源酶，最后激活其效應物Caspase-3，導致細胞凋亡〔16〕，使肌肉萎縮，肌力下降。同時，激活的Caspase-8能夠裂解Bcl-2家族成員Bid，裂解產物的羧基端片段tBid轉移到線粒體上，誘導線粒體cytC的釋放〔17〕，最終激活細胞凋亡執行因子Caspase-3，導致細胞凋亡。因此，可以通過抑制Caspase-3和Caspase-8的表達來阻斷骨骼肌細胞的凋亡，從而達到減緩肌肉衰減綜合征的發生及發展的效果。同時，肌肉衰減綜合征在中醫學上屬“痿證”范疇，其病因病機多為脾胃虧虛。那么從補益脾胃入手，觀察中藥貼敷后Caspase-3和Caspase-8的表達，以此來探討穴位貼敷對肌肉衰減綜合征的緩解是否有意義。