電針補腎益精法對圍絕經期血管性癡呆大鼠腦組織SOD、MDA含量的影響

宋 揚 徐天舒

（1.南京中醫藥大學中西醫結合鼓樓臨床學院，江蘇南京210023；2.南京鼓樓醫院，江蘇南京210008）

血管性癡呆（Vascular Dementia，VD）主要是由于出血或缺血性卒中導致人體行為和認知等腦區低灌注從而出現的認知功能障礙。已有研究發現，絕經是女性血脂異常的獨立危險因素，絕經后總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇均較絕經前明顯升高[1]，且隨著絕經年限的延長，升高越顯著，由此引發的腦血管疾病、VD成為圍絕經期及絕經后中老年女性需關注的問題。隨著醫療條件和技術的進步，腦血管病的死亡率在逐年下降，但因腦血管病造成的各類癡呆發生率卻在升高，因此對圍絕經期VD的研究具有現實和迫切的社會意義。大量研究表明，電針治療VD有較確切的療效[2-4]。我們前期研究發現，電針補腎益精法對圍絕經期大鼠有腦保護的作用[5]。為此，本研究采用電針治療圍絕經期VD模型大鼠，觀察其空間學習記憶能力，并檢測腦組織SOD、MDA水平，旨在研究電針對圍絕經期VD的治療作用。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 11～15月齡清潔級SD雌性大鼠，體重370g左右，上海斯萊克實驗動物有限責任公司，許可證號：SCXK（滬）2012-0017，飼養和實驗在南京大學醫學院附屬鼓樓醫院動物實驗中心屏障環境[SYXK（蘇）2014-0052]。

1.2 主要儀器與試劑 低溫高速離心機，分光光 度 計，Labsystems Finnpipette 100μL單 道 移 液器，Thermo 50μL 8道移液器，HH-4數顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司），MCAO栓線（北京沙東生物技術有限公司，型號為2432-50 AAAA），華佗牌SDZ-V型電子針療儀（蘇州醫療用品廠），0.25mm×13mm華佗牌一次性針灸針。

2 實驗方法

2.1 造模與分組 造模大鼠適應性飼養3d后連續5d行陰道分泌物采樣涂片，經HE染色后光鏡下觀察脫落細胞。鏡下連續5d呈現無規律動情周期變化則可確定為圍絕經期大鼠。用3.5%水合氯醛按1mL/100g體重將圍絕經期大鼠腹腔麻醉后，仰臥固定；頸正中切口，分離雙頸總動脈；用“0”號線結扎雙頸總動脈血流10min，再灌注10min，共間歇阻斷雙側頸總動脈血流3次，每次間隔10min；術后縫合切口，籠內飼養。假手術組大鼠僅分離雙頸總動脈不結扎。術后7d，對造模大鼠進行Morris水迷宮試驗以篩選入組大鼠。分別記錄每只大鼠的逃避潛伏期，計算假手術組逃避潛伏期的平均值（X），標準差（Y），以“X+2Y”為標準值[2]，如逃避潛伏期大于“X+2Y”則認為VD模型造模成功。將造模成功的大鼠隨機分為模型組和電針組，每組10只，假手術組取10只。

2.2 干預方法 電針組：固定大鼠，選取“關元”及雙側“三陰交”（大鼠穴位定位參考《實驗針灸學》），針刺得氣后，連接電子針療儀，以肢體微微抖動為度，連續波，頻率為2Hz，每次20min，每日1次，共治療20次。模型組、假手術組：每日同時間點固定20min。

2.3 行為學檢測 治療結束后各組大鼠行Morris水迷宮試驗檢測其定位航行能力。每日將大鼠面向池壁分別從4個入水點放入水中若干次，記錄其尋找到隱藏在水面下平臺的時間，即逃避潛伏期（escape latency）。記錄每只大鼠連續5d的逃避潛伏期平均值，計算每日每組大鼠潛伏期的平均值，評價各組動物空間學習記憶的獲得能力。

2.4 腦組織SOD、MDA含量測定 行為學檢測結束后，各組鼠斷頭處死，2min內取出大鼠腦組織，迅速置于冰盤上分離腦組織，棄取嗅球和小腦，與4℃預冷的生理鹽水一起倒入勻漿管中進行勻漿，充分研碎，使組織勻漿化，制成10%的腦組織勻漿，3000r/min離心10min，留上清液，4℃保存待測。按照SOD、MDA試劑盒說明書，用光電比色法測定大鼠腦組織中SOD活性、MDA含量。

2.5 統計學方法 采用SPSS 22.0統計軟件，計量資料用（±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，方差齊時采用t檢驗，方差不齊時采用t′檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 各組大鼠Morris水迷宮定位航行逃避潛伏期比較 結果見表1。隨著訓練時間的延長，各組大鼠在Morris水迷宮試驗中的上臺前游泳時間都呈現下降的趨勢。與同期假手術組比較，模型組大鼠各時期的逃避潛伏期均明顯延長（P＜0.05），說明VD模型建立成功，模型大鼠存在明顯的學習記憶障礙。與模型組比較，電針組大鼠的逃避潛伏期明顯縮短（P＜0.05），說明經過一段時間的治療后，“補腎益精”電針療法可明顯改善圍絕經期VD大鼠的學習記憶能力。

3.2 各組大鼠腦組織SOD、MDA水平比較 結果見表2，說明“補腎益精”電針法可有效改善圍絕經期VD模型大鼠腦組織SOD、MDA水平。

4 討論

VD發病多見于中老年人群，中國65歲以上人群中VD患病率為1.1%，約占癡呆總患病率的30%[6]。圍絕經期和絕經后婦女血脂異常率高[7]，并隨著絕經時間的延長，升高更顯著，由此損傷心腦血管造成缺血缺氧腦損害機率不斷升高。

表1 各組大鼠連續5d逃避潛伏期比較（±s） s

表1 各組大鼠連續5d逃避潛伏期比較（±s） s

注：△與假手術組比較，P＜0.05；#與模型組比較，P＜0.05。

假手術組 10 82.4±1.43 64.7±2.23 52.6±1.78 39.0±1.15 23.5±1.43模型組 10 96.9±1.52△ 89.3±1.49△ 77.4±1.35△ 69.2±1.14△ 61.9±0.99△電針組 10 88.1±1.97#75.7±1.52#66.1±1.73#52.3±1.42#41.5±2.46#

表2 各組大鼠腦組織SOD、MDA水平比較（±s）

表2 各組大鼠腦組織SOD、MDA水平比較（±s）

注：△與假手術組比較，P＜0.05；#與模型組比較，P＜0.05。

假手術組 10 178.00±24.02 1.04±0.18模型組 10 111.40±2.07△ 3.30±0.12△電針組 10 174.60±2.76# 1.30±0.09#

中醫學認為，VD是由于各種原因導致腎精虧虛，痰瘀阻痹，使腦髓空虛，腦髓失養，其基本病機為髓減腦消，神機失用，屬于“癡呆”“善忘”等范疇。圍絕經期VD又有其獨特的病因病機。婦女進入圍絕經期，腎氣漸衰，天癸將竭，沖任二脈虛損，腎精不足，臟腑功能紊亂，髓?？仗?，神機失守。故腎精虧虛為發病之本，治療以補腎益精為基本原則。三陰交是足太陰脾經、足少陰腎經和足厥陰肝經三條陰經交匯處。電針三陰交可以升高雌激素，抑制促性腺激素釋放激素（GnRH）分泌，調節下丘腦—腺垂體—卵巢軸，提高癡呆小鼠記憶能力[8]；關元穴位于有“陰脈之海”之稱的任脈，可養肝脾之氣血，能夠補腎益精，調理沖任。兩穴合用，可以補腎益精，充盈髓海，達到補腎益腦之效。

西醫學認為，因各種原因導致的腦缺血所引起的腦損害是VD發病的主要原因之一，而自由基是腦缺血、缺氧后神經細胞損傷的重要發病因素。自由基生成系統對學習記憶有明顯的損害作用，主要源于自由基對細胞及細胞膜上不飽和脂肪酸的破壞、過氧化及MDA產生。MDA是脂質發生過氧化反應后的分解產物，其通過交鏈蛋白質、糖類、核酸及脂類，使DNA發生突變，從而影響信息傳遞、轉錄和復制過程，致使蛋白質合成功能紊亂，合成能力下降，從而表現出記憶力和智力下降。MDA含量間接反映了自由基損害程度，含量越高，損害程度越高。SOD是機體直接清除自由基的重要抗氧化酶類，是機體新陳代謝中重要的金屬酶，其可對抗與阻斷因氧自由基對細胞造成的損害，并及時修復受損細胞。前期研究表明，電針補腎益精法對圍絕經期大鼠腦組織有一定保護作用[5]，能夠清除自由基，改善腦缺血、缺氧癥狀[9]。

本研究結果發現，與假手術組比較，模型組大鼠的Morris水迷宮定位航行逃避潛伏期時間明顯延長，說明VD模型建立成功，其存在明顯的學習記憶障礙。與模型組比較，電針組大鼠的逃避潛伏期明顯縮短，說明經過一段時間“補腎益精”電針的治療，圍絕經期VD大鼠的學習記憶能力得到明顯改善。腦組織檢測結果顯示，與假手術組相比，模型組大鼠腦組織SOD水平下降，MDA水平明顯上升，說明腦組織SOD、MDA水平與VD存在一定聯系。與模型組比較，電針組大鼠腦組織SOD水平明顯上升，MDA水平明顯下降，說明“補腎益精”電針法可有效改善圍絕經期VD模型大鼠腦組織SOD、MDA水平。

綜上，電針補腎益精法能提高圍絕經期VD大鼠自身的抗氧化能力，減輕VD引起的組織過氧化損傷，減少MDA含量，從而保護VD后繼發的神經元損傷。本研究初步探討電針補腎益精法對圍絕經期血管性癡呆大鼠腦保護機制，其他可能的作用機制還有待進一步研究。