兩種原核表達載體對CsPPO蛋白表達活性的影響

甘玉迪，孫康，李會娟，堵忠穎，趙真，龐鑫，黎星輝，陳暄

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兩種原核表達載體對CsPPO蛋白表達活性的影響

甘玉迪，孫康，李會娟，堵忠穎，趙真，龐鑫，黎星輝，陳暄*

南京農業大學園藝學院，江蘇 南京 210095

為了選擇合適載體，獲得穩定表達且具有高活性的可溶性茶樹多酚氧化酶，本研究以茶樹葉片為材料，克隆茶樹多酚氧化酶基因（CsPPO），切除含43個氨基酸和70個氨基酸的肽段后分別與pET32a載體、pMAL-c5X載體進行重組構建原核表達載體，分別命名為pET32a-CsPPO43、pET32a-CsPPO70、pMALc5X-PPO43、pMALc5X-CsPPO70，利用Transetta（DE3）菌株進行表達，經SDS-PAGE電泳檢驗，pMAL-c5X載體表達的目的蛋白易于提取，大量出現在上清液中；而pET32a載體表達后蛋白則基本存在于沉淀中。利用鄰苯二酚、ECG、EC 3種底物在410?nm處檢測CsPPO蛋白活性發現，pMALc5X-CsPPO對不同底物反應時酶活性隨時間增加均呈現明顯“S”型變化，表明茶樹PPO氧化兒茶素類的反應并不是勻速過程。pMALc5X-CsPPO43比活力比pMALc5X-CsPPO70的高，其中pMALc5X-CsPPO43與EC反應時酶比活力最高，最大比活力為1.45×106U·mg-1。因此，可利用pMALc5X-CsPPO43合成工業用PPO，為進一步研究其與兒茶素的反應機理，利用體外酶法高效獲得茶黃素奠定基礎。

茶樹；多酚氧化酶；原核表達；酶活性

多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）是存在植物體內的一種含銅質體金屬酶，對食品品質風味的形成有著重要影響[1]。根據茶葉的適制性，茶鮮葉中PPO含量越高，活性越大，越有利于紅茶品質的形成。在紅茶初制過程中，以兒茶素為主體的多酚類物質，在多酚氧化類物質的專一性多酚氧化酶以及過氧化酶的催化下，可能被空氣中的氧氣氧化成醌，形成的醌再經氧化縮合形成更為復雜的發酵產物如茶黃素、茶紅素和茶褐素，從而形成紅茶紅湯紅葉的品質特征[2]。

茶樹體內有較多PPO同工酶，不同茶樹品種與不同提取方法得到的茶樹PPO同工酶有2~10條[3-5]。茶黃素的酶促合成是獲取茶黃素的重要方法之一，但長期以來多以混合酶作為酶源使用，造成生產中反應條件不能固定[2]，同時，茶黃素、茶紅素等以兒茶素為底物聚合形成的分子機理也因沒有單一酶源而缺乏深入的研究。因此，如何從體外獲取高活性單一PPO酶源越來越受到研究者的關注。應用基因工程技術，構建表達工程菌，獲得工程蛋白酶，可以獲得穩定單一酶源，有利于茶黃素生產的標準化。番茄、蘋果、鴨梨等物種PPO基因在大腸桿菌中已得到表達，但表達產物活性都非常低[6-8]。趙東等[9]首次克隆了茶樹多酚氧化酶基因，劉敬衛、吳貽良等通過原核表達獲得了茶樹多酚氧化酶成熟蛋白[11-12]。劉敬衛等[11]認為在茶樹PPO原核表達中，切除轉移肽的PPO活性比全長PPO活性高，轉移肽對PPO活性具有抑制作用，本研究將茶樹PPO與其他物種PPO進行比對，擬選定兩個位置分別為第43個氨基酸和第70個氨基酸，切除轉移肽，構建重組原核表達載體，并表達成熟PPO，探究不同位置轉移肽對PPO活性的影響。王乃棟[13]獲得了茶樹多酚氧化酶真核表達蛋白。已有研究表明，根據宿主細胞的不同，可以分為原核和真核兩個表達系統。原核表達系統現今研究得較為成熟，操作簡便，表達蛋白產量較高，但是原核表達產物活性較低，可能是由于原核表達過程中誘導表達的目的蛋白產生包涵體[10-15]。盡管通過對形成包涵體的目的蛋白復性等手段能釋放部分可溶性酶，但酶活性會受到一定程度的影響。因此，本研究嘗試利用可溶性較大的載體pMAL-c5X，在不破壞酶本身活性的前提下，探索如何獲取可溶性高、酶活力高的PPO。

1 材料與方法

1.1 材料

茶樹品種“迎霜”鮮葉，2016年4月3日采摘于南京農業大學茶葉研究所實驗基地。取樣后立即放入液氮中冷凍，置于-80℃冰箱。

1.2 試劑

Marker、反轉錄試劑盒Prime ScriptTMRT reagent Kit、BamH I限制性內切酶、Xho I限制性內切酶、Sal I限制性內切酶、T4連接酶、IPTG等藥品均購于TaKaRa公司。EASYspin PlusRNA 提取試劑盒購自北京艾德萊生物，E.Z.N.A.TMGel Extraction Kit D2500-02，購自OMEGA。pEASY-Blunt Simple克隆載體、Transetta(DE3)、Trans1-T1克隆感受態細胞購于南京百斯凱科技有限公司。引物合成及測序由南京金斯瑞公司完成。

1.3 主要儀器

PCR儀（Takara，Japan），酶標儀Thermo（MK3，Multiskan，Helsinki，FI），電泳儀電源（DYY-6D型，北京市六一儀器廠），水平電泳槽（DYCP-31DN型，北京市六一儀器廠），蛋白電泳槽（DYCZ-24DN型，北京市六一儀器廠），細胞破碎儀（XO-1000D型，南京先歐儀器制造有限公司），冷凍離心機（Eppendorf, GER）。

1.4 CsPPO基因的克隆

根據NCBI Gen Bank中登錄的茶樹PPO基因EU787433.1設計引物，本試驗所需引物CsPPOF、CsPPOR見表1，普通PCR擴增。

1.5 CsPPO基因轉移肽的選擇與克隆

利用NCBI數據庫中BLAST進行同源比對分析，通過對比已知物種多酚氧化酶可變區位置，確定茶樹PPO轉移肽的位置。

表1 CsPPO原核表達引物

注：下劃線處為酶切位點。

Note: The underlines indicated the restriction sites.

1.6 CsPPO原核表達載體構建

分析CsPPO基因序列、pET32a載體和pMAL-c5X載體序列，引入與pET32a載體對應的BamH I、Xho I 酶切位點，與pMAL-c5X載體對應的Sal I、BamH I酶切位點。設計所需引物CsPPO43-BamH I-F、CsPPO70-BamH I-F、CsPPOXho I-R、CsPPO43-Sal I-F、CsPPO70-Sal I-F、CsPPOBamH IR（表1），具體操作方法見參考文獻[11]。

1.7 CsPPO融合蛋白的原核表達

將篩選出來的Rosseta-Vector-CsPPO目的菌株，在500?mL含有氨芐和氯霉素液體LB培養基中37℃培養至OD600為0.3~0.4，加入0.5?mL濃度為1?mmol·L-1IPTG 18℃過夜誘導培養20?h，離心并收集菌液。將菌體用0.01? mol·L-1pH 7的Tris-HCl緩沖溶液重懸，冰水浴超聲波破碎。取樣作為粗酶樣品，離心后分別取上清液和沉淀作為樣品分別進行SDS-PAGE檢測，SDS-PAGE電泳條件：5%濃縮膠，13%分離膠，電壓分別為100?V（濃縮膠），200?V（分離膠），上樣量20?μL。以pET32a、pMAL-c5X空表達載體表達產物為對照。

1.8 CsPPO酶活性測定

各酶上清液蛋白濃度測定方法采用Bradford方法。SDS-PAGE膠上蛋白條帶濃度用ImageJ計算實際蛋白含量[16]。

PPO酶活性測定方法：96孔酶標板中加入預先混勻的150?μL 0.1?mol·L-1pH 5.6的檸檬酸鉀緩沖液及40?μL誘導酶的上清液，置入酶標儀中37℃預熱20?min，分別加入10?μL 1?mg·mL-1的底物鄰苯二酚、EC、ECG。以煮沸10?min的酶蛋白液作對照。酶標儀達到測定溫度37℃時，將酶標板放入酶標儀中，在410?nm吸收波長下測定反應液的吸光值，每分鐘測定1次，共檢測1?h。酶活力單位（U）定義為：在該方法的測定條件下，反應液的 OD410值每分鐘增加0.001為1個活力單位[17]。比活力：每毫克蛋白所含的酶活力單位數。最大比活力：酶活力變化過程中最大斜率處的比活力。

2 結果與分析

2.1 CsPPO轉移肽的分析與選擇

通過DNAMAN生物信息分析軟件將茶樹PPO氨基酸序列與另外11種物種進行氨基酸序列比對。分別選擇第43和第70個氨基酸為轉移肽的位置（圖1）。

2.2 CsPPO原核表達載體的構建

以克隆得到的CsPPO（圖2-A）質粒為模板，利用酶切引物擴增出目的條帶，經雙酶切分別得到：pET32a載體酶切產物5?900?bp、CsPPO43-BamH I-Xho I酶切產物1?668?bp、CsPPO70-BamH IXho I酶切產物1?599?bp（圖2-B），pMAL-c5X載體酶切產物5?677?bp，CsPPO43-Sal I-BamH I酶切產物1?668?bp、CsPPO70-Sal I -BamH I酶切產物1?599?bp（圖2-C）。重組質粒后測序驗證，結果與預設的序列一致，表明重組載體構建成功，分別命名為pET32a-CsPPO43、pET32a-CsPPO70、pMALc5X-CsPPO43、pMALc5X-CsPPO70。預期蛋白分子質量分子量分別為82、79.15、107.06、104.21?kd。

2. 3 CsPPO重組蛋白的原核表達

對pET32a、pET32a-CsPPO43、pET32a-CsPPO70、pMAL-c5X、pMALc5X-CsPPO43、pMALc5X-CsPPO70進行IPTG低溫誘導表達，細胞破碎后SDS-PAGE電泳的結果顯示，粗酶中均出現與預期目的蛋白大小一致的條帶，而空載體則沒有出現此條帶（圖3），表明pET32a- CsPPO43、pET32a-CsPPO70、pMALc5X-CsPPO43、pMALc5X-CsPPO70重組質粒成功表達。

注：圖中箭頭為轉移肽切除位置。

Note: The arrowhead in the picture is the location of the transfer peptide.

圖1 茶樹CsPPO轉移肽位置的確定

Fig. 1 Identification of the location of CsPPO transfer peptide

注：A: CsPPO（1?800?bp）；B:雙酶切產物：1. pET32a（5?900?bp），2. pET32a-CsPPO43（1?668?bp），3. pET32a-CsPPO70（1?599?bp）；C:雙酶切產物：1. pMAL-c5X（5?677?bp），2. pMALc5X-CsPPO43（1?668?bp），3. pMALc5X-CsPPO70（1?599?bp）。

注：A：pET32a原核表達結果：粗酶、上清、沉淀中3條蛋白條帶從左向右的順序一致，分別為空載體、pET32a-CsPPO43(82?kd)、pET32a-CsPPO70(79.15?kd)。B：pMAL-c5X原核表達結果：粗酶、上清、沉淀中3條蛋白條帶從左向右的順序一致，分別為空載體、pMAL-c5X、pMALc5X-CsPPO43(107?kd)、pMALc5X-CsPPO70(104?kd)。圖中箭頭指向目的蛋白。

Note: A: pET32a vector prokaryotic expression results: the sequence of the three protein bands from left to right was identical in crude enzyme, supernatant, precipitate, which were pET32a, pET32a-CsPPO43(82?kd), pET32a-CsPPO70(79.15 kd). B：pMAL-c5X vector prokaryotic expression results: the sequence of the three protein bands from left to right was identical in crude enzyme, supernatant, precipitate, which were pMAL-c5X, pMALc5X-CsPPO43(107?kd), pMALc5X-CsPPO70(104?kd). The arrow points to the target protein.

圖3 兩種載體原核表達的SDS-PAGE電泳圖

Fig. 3 SDS-PAGE electrophoresis of two prokaryotic expression vectors

pET32a-CsPPO43、pET32a-CsPPO70蛋白的粗酶和沉淀中都含有目的條帶，但是上清液在電泳中未能見到明顯條帶，表明未能得到可溶性蛋白（圖3-A）；而pMALc5X-CsPPO43、pMALc5X-CsPPO70蛋白的粗酶、上清液、沉淀中都含有目的條帶，表明可以通過pMAL- c5X載體表達可獲得CsPPO可溶性蛋白（圖3-B）

2.4 CsPPO酶活性測定

2.4.1 以鄰苯二酚為底物CsPPO酶活性測定

CsPPO氧化鄰苯二酚反應的酶比活力變化（圖4），在反應1?h過程中，pMALc-5X空載體酶比活力變化微小，基本與X軸平行，pMALc5X原核表達載體表達的CsPPO酶比活力變化均呈現明顯“S”型變化，0~14?min pMALc5X-CsPPO43酶比活力變化緩慢從2.2× 105U·mg-1變化到3.0×105U·mg-1，15~34? minpMALc5X-CsPPO43酶比活力變化較快，從4.25×105U·mg-1變化到3.3×106U·mg-1，35~60?min pMALc5-CsPPO43酶比活力變化又逐漸變緩，從3.3×106U·mg-1變化到4.3×106U·mg-1；0~16?min pMALc5X-CsPPO70酶比活力從4.2×105U·mg-1變化到5.5×105U·mg-1，變化緩慢；17~27?min pMALc5X-CsPPO70酶比活力為從5.5×105U·mg-1變化到2.3×106U·mg-1，變化較明顯；28~60?min pMALc5X-CsPPO70酶比活力從2.3×106U·mg-1變化到2.4×106U·mg-1變化極小。pMALc5X-CsPPO43、pMALc5X-CsPPO70最大比活力分別為6.67×105U·mg-1、2.66×105U·mg-1（表2），pMALc5X- CsPPO43最大比活力約為 pMALc5X-CsPPO70的2.5倍。因SDS-PAGE中pET32a、pET32a-CsPPO43、pET32a-CsPPO70無明顯條帶，實際參加反應的蛋白含量無法估算，用總蛋白含量粗略計算酶比活力變化。相較pET32a，pET32a-CsPPO70酶比活力變化基本與其一致，兩者變化均不顯著，基本呈現雙曲線變化，而pET32a-CsPPO43酶比活力變化較顯著，呈近“S”型變化，酶比活力從6.6×104U·mg-1變化到3.9×105U·mg-1（圖4）。

圖4 以鄰苯二酚為底物CsPPO酶比活力變化

表2 以鄰苯二酚為底物CsPPO酶活性測定

2.4.2 以ECG為底物CsPPO酶活性測定

CsPPO氧化ECG反應的酶比活力變化（圖5），在反應1?h過程中，pMALc-5X空載體酶比活力基本無變化，pMALc5X原核表達載體表達的CsPPO酶比活力變化均呈現“S”型變化，0~37?min pMALc5X-CsPPO43酶比活力從6.2×105U·mg-1變化到7.4×105U·mg-1，變化較不明顯，38-55?min pMALc5X -CsPPO43酶比活力從7.4×105U·mg-1變化到2.8×106U·mg-1，變化較快，56~60?min pMALc5X- CsPPO43酶比活力從2.8×106U·mg-1變化到3.6×106U·mg-1，變化減緩。0~30?min pMALc5X-CsPPO70酶比活力從5.7×105U·mg-1變化到7.3×105U·mg-1，變化較微弱，31~44?min pMALc5X-CsPPO70酶比活力從7.3×105U·mg-1變化到1.1×106U·mg-1，變化略快，45~60?min pMALc5X-CsPPO70酶比活力從1.1×106U·mg-1變化到1.2×106U·mg-1，變化極微弱。pMALc5X-CsPPO43、pMALc5X- CsPPO70最大比活力分別為5.78×105U·mg-1、1.08×105U·mg-1（表3），pMALc5X-CsPPO43最大比活力約為pMALc5X-CsPPO70的5.35倍。相較pET32a，pET32a-CsPPO70酶比活力變化非常小，呈現緩平的直線。pET32a-CsPPO43酶比活力變化略微顯著，酶比活力從8.3×104變化到1.55×105U·mg-1，呈“S”型變化（圖5）。

圖5 以ECG為底物CsPPO酶比活力變化

表3 以ECG為底物CsPPO酶活性測定

2.4.3 以EC為底物CsPPO酶活性測定

CsPPO氧化EC反應的酶比活力變化（圖6），在反應1?h過程中，空載體pMALc-5X酶比活力基本沒變化，pMALc5X原核表達載體表達的CsPPO酶比活力變化均呈現“S”型變化，0~18?min pMALc5X -CsPPO43酶比活力變化為非常微小，酶比活力大小約為2.4×106U·mg-1，19~45?min pMALc5X-CsPPO43酶比活力從2.4×106U·mg-1變化到1.1×107U·mg-1，變化非常顯著，46~60?min pMAL c5X-CsPPO43酶比活力變化不明顯，酶比活力大小估算值約為1.1×107U·mg-1。0~20?min pMAL c5X-CsPPO70酶比活力為從6.4×105U·mg-1變化到7.0×105U·mg-1，酶比活力大小，基本保持不變，21~32?min pMALc5X-CsPPO70酶比活力從7.0×105U·mg-1變化到3.1×106U·mg-1，變化較為顯著，33~60?min pMALc5X-CsPPO70酶比活力從3.1×106U·mg-1變化到4.3×106U·mg-1，酶比活力變化趨于緩慢。pMALc5X-CsPPO43、pMALc5X-CsPPO70最大比活力分別為1.45× 106U·mg-1、5.73×105U·mg-1（表4），pMALc5X- CsPPO43最大比活力約為pMALc5X-CsPPO70的2.5倍。相較pET32a，pET32a-CsPPO43、pET32a-CsPPO70酶比活力變化均明顯，呈現出“S”型變化，0~16?min pET32a-CsPPO43酶比活力從1.6×105U·mg-1變化到1.27×105U·mg-1，酶比活力略有下降，但變化極小，17~ 49?min pET32a-CsPPO43酶比活力從1.27×105U·mg-1變化到5.42×105U·mg-1，變化較快，50-60?min pET32a-CsPPO43酶比活力變化為從5.42×105U·mg-1到5.66×105U·mg-1，酶比活力基本沒變，0~6?min從1.55×105U·mg-1到1.93×105U·mg-1，酶比活力變化較小，7~29?min從1.93×105U·mg-1pET32a-CsPPO70酶比活力變化為變化到4.45×105U·mg-1，變化略快，30~60?min酶比活力變化為從4.45×105U·mg-1到4.39×105U·mg-1，酶比活力略有下降，但變化極其微弱（圖6）。

圖6 以EC為底物CsPPO酶比活力變化

表4 以EC為底物CsPPO酶活性測定結果

3 討論

PPO不僅在植物生長發育過程中有著重要的作用，而且在工業生產上也是有著非常重要的作用。茶黃素是紅茶加工中產生的重要色素，是由兒茶素物質如L-EC、L-EGC、L-ECG、L-EGCG等經PPO氧化生成，具有抑菌、抗病毒、降血糖、降血脂、降血壓、抗氧化、抗突變、抗衰老、抗癌防癌等方面的作用[18]。體外酶法合成茶黃素效率并不高，這與PPO酶活性不穩及反應機理復雜有關，因此找到合適、穩定的PPO酶源極為重要。目前用于茶黃素合成的PPO，一種方法是從植物體內提取，在生產中往往使用粗酶，無法定性定量。另外一種方法是通過體外表達工程蛋白酶，可高效生產大量單一酶源，在生產中更具可控性。但是目前通過基因工程獲得CsPPO，酶活性較低。陳東生等[18]認為可能是由于PPO是一種含銅質體金屬酶，若使PPO具有活性，它需要銅離子結合并形成正確的三維結構；而且原核表達過程中沒有翻譯后的加工過程，因此蛋白不能夠正確的折疊，從而容易形成包涵體，使酶活性降低。

本研究通過對兩種原核表達載體的構建與誘導，結果表明均可成功表達CsPPO。但SDS-PAGE條帶顯示使用pET32a原核表達載體表達的CsPPO出現在沉淀中，上清液中基本沒有出現，表達的目的蛋白可能形成包涵體，無法獲得可溶性CsPPO，與劉敬衛等[11]研究結果相同。而pMAL-c5X原核表達載體表達的CsPPO出現在上清液中，可得到可溶性CsPPO。pMAL載體都具有麥芽糖結合蛋白（MBP）融合體，是一種高度可溶的標簽蛋白質[19-20]。因此，也可以利用其進一步純化CsPPO。

研究表明，在大腸桿菌中表達CsPPO，轉移肽會抑制活性[15]。本試驗嘗試切除不同的轉移肽，從酶比活力結果可以看出pMAL-c5X原核表達載體表達的CsPPO中，pMALc5X-CsPPO43比活力比pMALc5X- CsPPO70的高。利用鄰苯二酚、ECG、EC 3種底物在410?nm處檢測CsPPO蛋白活性發現，最大比活力分別為：6.67×105U·mg-1、5.78×105U·mg-1、1.45×106U·mg-1，可以看出在這3種底物中pMALc5X-CsPPO43與EC反應時最大比活力最高。

另外試驗中發現pET32a原核表達載體表達的CsPPO上清液中蛋白含量太低，可能無法穩定表現酶特性，與不同底物反應時不能呈現出有規律的酶比活力變化趨勢。而pMAL-c5X原核表達載體表達的CsPPO在上清液中蛋白含量較高，能夠穩定表現酶的特性，與不同底物反應時酶比活力變化隨時間增加均呈現明顯“S”型變化，表明CsPPO氧化鄰酚類的反應并不是勻速過程?？赡茉?10?nm處檢測的是黃色醌類物質，而在形成終產物醌之前可能需要形成中間產物，當中間產物達到一定濃度后，反應才能順利進行，表現為在酶比活力曲線上呈現出反應前期較平緩，隨后快速升高的現象，因此，在CsPPO酶活性測定中不同反應時間測定出的酶活性可能不同，可以采用酶標儀連續測定，結果會更加準確。

本研究提供一條利用pMALc5X載體獲得可溶性高、活性高的CsPPO原核表達途徑，為茶黃素體外合成奠定基礎，但其表達產物的純化、酶反應活性變化及氧化鄰酚類機理仍需進一步的研究。

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Effect of Two Prokaryotic Expressed Vectors on the Activity of PPO from

GAN Yudi, SUN Kang, LI Huijuan, DU Zhongying, ZHAO Zhen, PANG Xing, LI Xinghui, CHEN Xuan*

College of Horticulture, Nangjing Agricultural University, Nanjing 210095, China

To get stably soluble tea polyphenol oxidase with high activity, two vectors were selected to express CsPPO. A tea polyphenol oxidase gene was cloned from tea leaves. After trimming two peptide fragments with 43 and 70 amino acids, the sequences were connected into pET32a and pMAL-c5X vectors with BamH I/xho I and Sal I/ BamH I and named as pET32a-CsPPO43, pET32a-CsPPO70, pMALc5X-CsPPO43and pMALc5X-CsPPO70respectively. After expressed of recombinant plasmids in theTransetta (DE3) strain, SDS-PAGE results showed that the protein expressed by pMAL-c5X was easier extracted than that by pET32a. The proteins expressed by pMAL-c5X were found in both the supernatant and pellet, while those by pET32a were only found in the pellet. The activity of CsPPO was detected by 1,2-benzenediol, ECG and EC as substrates in 410 nm with micro-plate reader. The ‘S’ shaped curves graphed with three substrates oxidized by the pMALc5X-CsPPO indicated that all reaction speeds were not constant. The specific activity of pMALc5X-CsPPO43was higher than that of pMALc5X-CsPPO70, with the highest activity reaching 1.45×106U·mg-1when reacted to EC. Therefore, pMALc5X-CsPPO43could be used to synthesize industrial PPO, but its role in catechin mechanism still needs further research.

, polyphenol oxidase, Prokaryotic expression, enzymatic activity

TS272.2；Q52

A

1000-369X(2018)04-396-10

2018-04-04

2018-04-26

國家現代農業產業技術體系建設專項資金（CARS-19）、國家自然科學基金（31470690）、江蘇省現代農業產業技術體系（sxgc2017223）、南京農業大學SRT項目（1614C12）

甘玉迪，女，碩士研究生，主要從事茶樹遺傳育種和茶葉生化研究。*通訊作者：chenxuan@njau.edu.cn