茶樹PPO基因家族的鑒定與分析

曾澤媛，羅勇，鄭楚楚，李娟,2,3，李勤,2,3，林海燕,2,3，王坤波,2,3

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茶樹PPO基因家族的鑒定與分析

曾澤媛1，羅勇1，鄭楚楚1，李娟1,2,3，李勤1,2,3，林海燕1,2,3*，王坤波1,2,3*

1. 湖南農業大學茶學教育部重點實驗室，湖南 長沙 410128；2. 國家植物功能成分利用工程技術研究中心，湖南 長沙 410128；3. 湖南省植物功能成分利用協同創新中心，湖南 長沙 410128

多酚氧化酶（Polyphenol oxidases,PPO）是由核酸編碼的一種以氧為受體的含銅金屬酶，為一種末端氧化酶，在茶葉加工中也發揮重要的作用。從最新發布的茶樹基因組數據庫中獲得了5條PPO基因：、、、（GenBank登錄號為GQ129142.1）、。本研究利用生物信息學方法，對5條基因的核酸序列和氨基酸序列進行分析，并對基因編碼蛋白的理化性質和結構功能進行預測。結果表明，5個基因CDS區全長在597~1?839?bp之間，編碼氨基酸數目198~612；系統進化樹分析顯示、、和具有較近的親緣關系；編碼的蛋白均屬于親水性不穩定類脂類結合蛋白，都不具有信號肽；無規則卷曲是蛋白質的主要結構元件，α-螺旋和β-折疊分散于整個多肽鏈中，、、可能存在一個或多個跨膜螺旋；5個蛋白均含有PPO1_DWL（pfam12142）保守結構域，除了外，其余4個蛋白均預測到TYROSINASE功能結構域。實時定量PCR結果表明，PPOs基因在不同茶樹品種間呈現出不同的表達模式。

茶樹；多酚氧化酶；基因家族；序列分析

多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO，EC1.10.3.1）是一種在自然界很多生物體中分布廣泛的含Cu結合酶[1]，是引起蔬菜、水果、茶葉等農產品酶促褐變的主要酶類，在蓮藕[2]、鴨梨[3]、丹參[4]、荔枝[5]、蘋果[6]等中都有著重要的作用，不僅影響產品的感官質量，還會造成某些營養物質的破壞和商業價值的降低[7]。在紅茶的初加工過程中，PPO發揮著重要作用，將多酚氧化成鄰醌，然后再氧化聚合形成茶黃素[8]，茶黃素的含量與紅茶品質呈高度正相關。此外，人們發現PPO與植物的抗病性也有關系，不僅能通過催化木質素及酮類化合物的形成，形成保護層，使細胞免受病菌的侵害，還能通過形成酮類物質直接起到抗病作用，同時也與鮮花中花青素的形成有關[9]。

關于茶樹PPO基因的研究，大多圍繞單個基因序列的分析[10]，PPO的原核表達[7,11-12]等。為全面解析茶樹基因組PPO基因信息，本研究利用生物信息學方法，將4個未報道的茶樹PPO基因與已有研究的從核酸序列以及編碼的氨基酸序列的性質及系統演化關系等方面進行鑒定、分析和比較，同時對其編碼蛋白的功能結構域以及二、三級結構進行了預測，以期能更大限度的預測新的4個PPO基因的功能和作用，為進一步研究這些PPO基因功能、家族進化過程提供理論依據，為開展茶樹分子育種提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

從最新發布的茶樹基因組數據庫（http:// www.plantkingdomgdb.com/tea_tree）獲得5個PPO基因的數據；茶樹（）、普洱茶（var.）、可可茶（）、金花茶（）、龍眼（）、川桑（）、胡楊（）、橄欖（）、梨（）的相關蛋白序列從美國國立生物技術信息中心（NCBI：https://www.ncbi.nlm.nih. gov）網站下載。

茶樹鮮葉樣品采自湖南農業大學長安茶樹資源圃，品種為金牡丹、金觀音、福鼎大白、碧香早、桃源大葉、紅芽佛手，采摘標準為一芽二葉。

1.2 方法

生物信息學分析所用分析程序有：利用SMS（Sequence Manipulation Suite）分析PPO基因的核酸序列；利用ExPASy-Translation Tool翻譯成氨基酸序列，用在線軟件ProParam分析其理化性質；用DNAMAN V6軟件比對氨基酸序列一致性；利用CDD（Conserved Domain Database）在線數據庫分析編碼蛋白的保守結構域；利用ScanProsite在線數據庫進行功能結構域的預測；用MEGE5軟件中的Neighbor Joining法構建系統進化樹；利用SignalP 4.1 Server對編碼的蛋白進行信號肽分析；用TargetP 1.1 Server 對編碼的蛋白進行細胞定位分析；利用TMpred Server對編碼蛋白的跨膜結構域進行在線預測；利用PSIPRED在線數據庫和Swiss-Model數據庫對編碼的蛋白進行二、三級結構預測分析。

2 結果與分析

2.1 茶樹PPO基因家族的核酸序列的基本分析

利用SMS對所得的PPO基因的核酸序列進行在線分析，結果顯示（表2）、、的序列較長，全長1?242~1?839?bp，和的序列較短，前者序列全長597?bp，后者序列全長825?bp。堿基對的比例除外，其他4個相互之間相差很小，的堿基G+C含量略低4.10%~4.81%，堿基A+T含量略高4.10%~4.81%。總體來說，除差異較大外，其他4個基因的核酸序列差異較小。

表1 熒光定量PCR引物序列

表2 PPO基因家族的核酸序列分析

2.2 茶樹PPO家族基因編碼蛋白的理化性質

利用ExPASy-Translation Tool將所得的PPO基因的核酸序列翻譯成氨基酸序列，然后用在線軟件ProParam分析其理化性質[13]。結果顯示（表3）在PPO基因家族轉錄的氨基酸序列中相對分子量最小的是，為22.01?kD，最大的是，為68.05?kD；理論等電點范圍5.87~6.49；帶負電荷殘基數量29~81，帶正電荷殘基數量24~74，其中所帶正負電荷殘基數量均最少，所帶正負電荷殘基數量均最多，且每個氨基酸序列所帶的帶負電荷殘基數量均大于其所帶正電荷殘基數量；不穩定系數37.19~45.96；脂類結合蛋白質指數66.71~93.43；組成成分中以天冬氨酸（Asp）、亮氨酸（Leu）、脯氨酸（Pro）居多。

用ExPASy-ProtScale對所得氨基酸序列的疏水性/親水性進行在線預測（圖1），分值最大，為–0.900，分值最小，為–1.800，其余3個分值–1.533~–1.234，分值均為負數，故可認為其均為親水性蛋白。

2.3 茶樹PPO基因家族編碼的氨基酸序列比對及系統進化分析

用DNAMAN V6軟件對PPO基因家族轉錄的氨基酸序列進行比對，結果表明，和與其他PPO基因轉錄的氨基酸序列一致性相對較高，其中與、、、的一致性分別是44.95%、3.94%、56.31%、31.23%；與其他PPO基因轉錄的氨基酸序列一致性最低，與、、、的一致性分別是4.57%、3.94%、4.73%、4.57%。對PPO基因家族核酸序列進行比對分析，結果表明，與其他4個一致性依然較高，一致性依然最低。用MEGN5構建5個基因編碼蛋白的系統進化樹（圖2-A），發現的親緣關系確實較遠。

表3 PPO基因家族轉錄的氨基酸序列的組成成分及理化性質分析

圖1 CsPPOs編碼蛋白疏水性/親水性的預測

通過NCBI的CDD在線數據庫分析，得、、、、氨基酸序列的保守結構域（圖2-B），每個序列都含有PPO1_DWL（pfam12142）結構域，除都含有Tyrosinase（pfam00264）結構域，除和外都含有PPO1_KFDV（pfam12143）結構域。PPO1_DWL長約50個氨基酸，是一個保守的序列基序，且有研究表明，該結構域有調節多酚氧化酶活性的作用[14]。將5個基因轉錄的氨基酸序列與已知的茶樹（ACJ04908.1）、普洱茶（var.ABF19602.1）、可可茶（ABF19601.1）、金花茶（ACM43505.1）、龍眼（AKJ70977.1）、川桑（XP_010100570.1）、胡楊（AEL95440.1）、橄欖（AEY78528.1）、梨（BAB64530.1）的多酚氧化酶氨基酸序列以及利用NCBI獲取PPO1_DWL的consensus片段輸入DNAMAN中進行比對，選取該結構域的比對部分（圖3），發現除了外，其他PPO的PPO1_DWL結構域都比較保守，其中的一個酪氨酸（Tyrosinase）更是高度保守，可以推測該結構域在不同植物的PPO蛋白中有著相似的作用。Tyrosinase是位于序列中部長約210個氨基酸的結構域，含CuA和CuB結合區[14]。將5個基因編碼的氨基酸序列輸入ScanProsite在線數據庫進行功能結構域的預測，結果與上一致（表4），、和轉錄的蛋白均含有TYROSINASE_1和TYROSINASE_2，只含有TYROSINASE_2，沒有預測到該功能結構域。TYROSINASE_1由18個氨基酸殘基組成，其中位于酪氨酸酶N端的組氨酸可與CuA結合，且與PPO的水溶性有關[14]；TYROSINASE_2由12個氨基酸殘基構成，CuB能與另一個組氨酸在酶的活性中心結合。這與Cary J W等[15]提出的PPO含有兩個Cu結構域相符。由此可見，、與功能結構域一致，具有相似的功能，而和轉錄的蛋白沒有此功能結構域，推測可能是因為這2個基因不具備相關的功能。

圖2 PPO基因家族編碼蛋白的進化關系和保守結構域

表4 PPO基因家族轉錄的氨基酸序列結構域預測

注：Cs：茶樹，Cs var.：普洱茶，Cp：可可茶，Cn：金茶花，Dl：龍眼，Mn：川桑，Pe：胡楊，Ca：橄欖，Pp：梨。

用MEGA5進化分析表明（圖4）：、、和山茶屬植物親緣關系較近；與龍眼親緣關系較近，與山茶屬植物親緣關系相對較遠；則親緣關系最遠，可能在結構功能方面會與差別較大。高度保守的結構域可以作為判斷不同物種間親緣關系的重要依據[16]，此結果對研究茶組植物的親緣進化關系具有指導意義。

2.4 茶樹PPO基因編碼蛋白的信號肽與細胞定位分析

信號肽是位于新合成肽鏈N段的用來引導新合成的肽鏈轉移到內質網的一段多肽，一般含15~30個氨基酸殘基，含6~15個帶正電荷的非極性氨基酸[17]。采用信號肽的分析方法可判斷該蛋白是否為分泌蛋白，同時推測其細胞定位[18]。利用SignalP 4.1 Server對5個PPO基因轉錄的氨基酸序列進行預測，按照默認的神經網絡模型（Neural networks）和隱馬爾可夫模型（Hidden Markov models）進行信號肽分析，結果表明（表5）分值都低于0.5，且Signal peptide結果均為no，說明4個PPO基因編碼的蛋白與一樣，不存在信號肽，屬于非分泌蛋白，合成后不進入內質網和高爾基體分泌途徑，直接釋放于細胞質中[19-20]。

然后，用TargetP 1.1 Server對編碼的蛋白進行細胞定位分析，結果表明，和編碼蛋白定位于葉綠體中的可能性最大，因此用ChloroP 1.1 Server對其在葉綠體的轉運肽進行預測，可能性均大于0.5，預測這兩個蛋白含有葉綠體轉運肽，長度分別為45和39個氨基酸；、和編碼的蛋白定位于非葉綠體和非線粒體的其他位置的可能性最大。

2.5 茶樹PPO基因編碼蛋白跨膜結構域的預測與分析

利用TMpred Server進行在線預測，結果表明：、、、、都有可能有膜內側向膜外側的跨膜區域，但其中、的分值均低于500，沒有顯著意義，可能不存在跨膜螺旋；含有一個膜內側向膜外側的跨膜區域，位于多肽鏈第74位到96位（分值：1370），另還有一個膜外側向膜內側的跨膜區域，位于第75位到97位（分值：1?230）；含有一個膜外側向膜內的跨膜區域，位于第1位到19位（分值：806）；含有兩個膜內側向膜外側的跨膜區域，位于第63位到84位（分值：921），另一個位于第223位到241位（分值：542），還含有一個膜外側向膜內的跨膜區域，位于第64位到87位（分值：702）；跨膜區域與圖1預測結果一致，由疏水性氨基酸構成，這表明這3個基因編碼的蛋白可能存在一個或多個跨膜螺旋，可能承擔了調節細胞膜內外溶質與離子傳輸、細胞間通信、以及細胞的“感覺器官”等作用[21]。

表5 PPO基因家族轉錄的氨基酸序列的信號肽分析

圖4 茶樹PPO與其他植物的PPO進化關系

2.6 茶樹PPO基因編碼蛋白的二、三級結構預測

通過對蛋白質進行二、三級結構預測，能讓我們更深入了解該蛋白質的功能，利用PSIPRED在線數據庫對5個PPO基因編碼的氨基酸序列進行預測分析，其中編碼的蛋白（圖5）含α-螺旋（α-Helix，13.50%）、β-折疊（β-Strand，15.01%）和大量無規則卷曲（C-coil，71.49%），其他4個蛋白由1~8個α-螺旋（Helix）、4~17個β-折疊（Strand）和大量無規則卷曲（C-coil）組成（表6），且分布于整個蛋白中，除外，組成比例與差異不大。PPO蛋白中α-螺旋可能包含活性位點，β-折疊則是催化基質或失活的延長結構[22]。利用Swiss-Model數據庫，將5個PPO基因編碼的蛋白進行同源建模預測分析，只有、和（圖6）成功建模，模板均為5ce9.1.A，與之同源性依次為68.57%、68.75%、69.35%，而該模板的描述正是多酚氧化酶。

2.7 茶樹PPO基因家族的表達分析

為分析5個PPO基因在不同茶樹品種間的表達模式，對金牡丹、桃源大葉、金觀音、紅芽佛手、碧香早、福鼎大白茶進行了RT-PCR定性及實時熒光定量PCR。結果表明（圖7），、、在福鼎大白茶中都有較高的表達；、則分別在碧香早和桃源大葉中有更高的表達；其中在桃源大葉、金觀音和紅芽佛手中微量甚至沒有表達。RT-PCR定性分析結果與定量分析結果一致，說明不同PPO基因在不同茶樹品種間表達存在差異。研究表明同一組織的不同組織器官、同一組織器官的不同發育時期、PPO基因家族中不同成員之間，PPO基因都具有不同的表達模式[23]，如在馬鈴薯葉片中克隆出來的PPO基因只在葉、根、花中表達，而在塊莖中不表達[24]；在番茄花分生組織中分離出來的PPO基因只在花原基中表達，在其他發育階段不表達[25]。劉仲華等[26]研究表明，在紅茶加工過程中，低分子PPO酶帶活性較強的茶樹品種，發酵啟動較快，但隨著發酵的進行，這些酶蛋白很容易失活，而高分子PPO酶蛋白卻一直維持在相對較高的水平，能使發酵均勻一致。研究PPO基因與PPO同工酶的關聯，對不同茶類的加工具有指導意義。在茶樹品種選育過程中，可以根據5個PPO基因在不同品種間的表達差異性，利用雜交或其他育種手段，培育出適制性更強的茶樹品種。因此，研究茶樹PPO基因家族及其酶蛋白的功能，對指導茶樹分子育種和茶葉加工都具有重要指導意義。

圖6 CsPPO5編碼蛋白的空間構象

3 討論

PPO基因家族通常由1個小基因家族編碼，閆洪波等[27]研究表明，蘋果中有16個PPO基因，梨中有8個PPO基因，桃、草莓和黑樹莓各自有6個PPO基因，并認為PPO基因數量在不同物種之間的差異是由PPO基因倍增和丟失差異引起的。本文在茶樹全基因組水平上鑒定茶樹的5個PPO基因，其中、、均定位于Sc0000413號染色體，且集中在155~170?kb區段，和分別位于Sc0002867和xfSc0001447號染色體上。PPO蛋白的前體一般由N-端導肽（Transit petide）、N-端催化結構域、PPO1_DWL結構域、PPO1_KFDV結構域幾個部分組成[28-29]。王乃棟等[7]，潘宇等[30]對茶樹PPO基因研究發現，茶多酚氧化酶不具有信號肽，無跨膜區，存在2個銅離子結合域。本研究利用此方法預測結果表明，這5個PPO基因編碼的蛋白均屬于親水性不穩定類脂類結合蛋白；每個序列都含有PPO1_DWL、PPO1_KFDV和Tyrosinase中的1個或2個結構域；都不具有信號肽；無規則卷曲是蛋白質的主要結構元件，α-螺旋和β-折疊分散于整個多肽鏈中；、、可能存在1個或多個跨膜螺旋，、不存在跨膜螺旋；、和轉錄的蛋白均含有TYROSINASE_1和TYROSINASE_2功能域，只含有TYROSINASE_2，沒有預測到功能結構域。雖然5個PPO基因都含有PPO1_DWL結構域，但在不同茶樹品種間呈現出了不同的表達模式。、、在這6個茶樹品種中表達相對較高；而、表達較低，推測可能需要外源機械損傷、生物以及其他非生物逆境因素來誘導這些基因的表達[31-33]，茉莉酸甲酯處理茶樹可顯著提高PPO基因的表達量[31]，受病蟲害侵襲的蘋果葉片中PPO的表達明顯高于對照，且受傷的蘋果幼果在18?h后仍能檢測到PPO基因的高表達[6]。

表6 PPO基因家族轉錄的蛋白二級結構預測

圖5 CsPPO4編碼蛋白的二級結構預測

注：JGY：金觀音，TY：桃源大葉，JMD：金牡丹，HYFS：紅芽佛手，BXZ：碧香早，FD：福鼎大白。

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The Identification and Analysis of Polyphenol Oxidase Gene Family in Tea Plant()

ZENG Zeyuan1, LUO Yong1, ZHENG Chuchu1, LI Juan1,2,3, LI Qin1,2,3, LIN Haiyan1,2,3*,WANG Kunbo1,2,3*

1. Key Laboratory of Ministry of Education for Tea Science, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China;2. National Research Center of Engineering Technology for Utilization of Botanical Functional Ingredients, Changsha 410128, China;3. Collaborative Innovation Center of Utilization of Functional Ingredients from Botanicals, Changsha 410128, China

Polyphenol oxidase (PPO) is a copper-containing metal enzyme, which plays an important role in tea processing. Five PPO genes were found in the tea genome database:,,,(GenBank Access. No. GQ129142.1) and. The nucleic acid and amino acid sequences of five PPO genes were analyzed, and the physicochemical properties and structural functions of the PPO genes encoding protein were also predicted by bioinformatics method. The results showed that the full length of the five PPO genes coding sequences (CDS) was between 597?bp and 1?839?bp which could encode 198-612 amino acids. Phylogenetic tree analysis showed that,,andhad close genetic relationships. The encoded proteins belonged to hydrophilic and unstable lipid binding proteins and had no signal peptides. Irregular curl was the main structural element of protein in which α-helix and β-strand were dispersed throughout the polypeptide chain &,,might contain one or more transmembrane spirals. The five PPO proteins contained PPO1_DWL (pfam12142) conserved structural domains. It was predicted that the proteins encoded by,,andmight contain tyrosinase functional domains. Real-time reverse transcription (qRT-PCR) analysis showed that the PPO genes showed different expression patterns among different tea cultivars.

tea plant, polyphenol oxidase, gene family, sequence analysis

TS272.2；Q52

A

1000-369X(2018)04-385-11

2018-01-26

2018-03-20

國家自然科學基金（31670691，31500567）、湖南省教育廳科研項目（15B116）

曾澤媛，女，碩士研究生，主要從事茶樹分子生物學方面的研究。*通訊作者wkboo163@163.com