陳年六堡茶對高脂血癥小鼠的調脂護肝作用研究

吳文亮，劉仲華，林勇，黃建安，左高隆，滕翠琴，龍志榮，邱瑞瑾，曹中環

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陳年六堡茶對高脂血癥小鼠的調脂護肝作用研究

吳文亮1,2,3,4，劉仲華1,2,3*，林勇1,2,3*，黃建安1,2,3，左高隆1,2，滕翠琴5，龍志榮6，邱瑞瑾5，曹中環5

1. 湖南農業大學茶學教育部重點實驗室，湖南 長沙 410128；2. 國家植物功能成分利用工程技術研究中心，湖南 長沙 410128；3. 植物功能成分利用協同創新中心，湖南 長沙 410128；4. 湖南省農業科學院茶葉研究所，湖南 長沙 410125；5. 梧州市六堡茶研究院，廣西 梧州 543003；6. 梧州市茶產業發展辦公室，廣西 梧州 543003

為了探討陳年六堡茶的調脂保肝功效，比較分析了不同年代六堡茶的主要化學物質的差異，再以高脂高糖飲食建立高脂血癥小鼠模型，并用選定的陳年六堡茶水提物灌胃小鼠，觀察小鼠相關生理生化指標及組織形態的變化。結果表明，陳化15年茶樣被選為陳年六堡茶的代表，用于后續試驗。與模型組相比，陳年六堡茶尤其中高劑量條件下能有效減輕高脂血癥小鼠體重、肝重和降低肝系數，顯著提高高密度脂蛋白-膽固醇（HDL-C）含量，降低血清中總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）和低密度脂蛋白-膽固醇（LDL-C）含量，降低谷丙轉氨酶（ALT）和谷草轉氨酶（AST）活力，改善大鼠肝臟氧化應激狀態，具有統計學意義（<0.05或<0.01）。肝臟和脂肪組織病理切片顯示，陳年六堡茶能明顯減少肝細胞中脂滴的形成和抑制脂肪細胞膨大，呈劑量依賴關系。綜上表明，陳年六堡茶在正常劑量條件下能有效改善因高脂高糖飲食所致的小鼠脂質代謝紊亂和肝臟損傷。

陳年六堡茶；高脂血癥；脂質代謝；肝損傷；改善作用

六堡茶屬黑茶類，是廣西具有地理標志及濃郁地方特色的名優農產品[1-2]，原產于廣西梧州市蒼梧縣六堡鎮，生產歷史悠久，風味獨特，是廣西傳統的出口產品[3-4]。近年來，隨著黑茶的熱銷，六堡茶因“紅、濃、陳、醇”的獨特品質特征深受消費者青睞[5]，品牌價值不斷提升，目前年產量已超1.2萬t，產值達12.8億元以上。

隨著當前百姓生活水平提高，高脂高糖飲食增加，是造成近年來機體脂質代謝紊亂、非酒精性脂肪肝及肥胖等代謝綜合征高發的主要原因[6]。國內外大量研究[7-10]表明，茶及其內含成分具有調脂保肝作用，其中綠茶和紅茶相關報道最多。素有“越陳越好”的黑茶主要以普洱茶和茯磚茶相關研究較多[11-13]。近年來隨著六堡茶品牌價值的提升，也有了六堡茶調脂保肝相關功效研究的報道[14-16]，但是選用的都是年代較新的茶樣。雖然六堡茶如同其他黑茶（普洱茶、茯磚茶等）一樣都有“越陳越好”的說法，但是隨著陳化時間的增加，它們的主要化學物質含量下降[17-20]。劉澤森等[20]指出六堡茶隨陳化年份的延長其水浸出物、茶多酚、氨基酸、茶黃素及茶紅素等物質呈逐漸下降的趨勢。目前，已有的文獻對“越陳越好”的解釋還只是基于感官審評的綜合評分上，如“越陳越香”或/和“越陳越醇”[20-21]。考慮到功效由化學物質基礎決定，陳年六堡茶在降脂保肝方面到底有沒有效果一直沒有明確的數據支持。鑒于此，本研究選取了陳化時間較長，并且具代表性的六堡茶樣作為試驗材料，基于高脂血癥小鼠模型全面評估陳年六堡茶的調脂護肝作用，以期為陳年六堡茶甚至陳年黑茶的品質和功效的研究提供試驗依據，為健康飲茶及六堡茶產業發展提供科技支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 茶葉樣品

六堡茶均為廣西壯族自治區梧州茶廠提供的同一級別散茶，分別陳化1、5、10、15年，每個年代茶樣取3個重復。

1.1.2 試驗動物

SPF級雄性昆明種（KM）小鼠，體質量20?g左右，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，生產許可證號：SCXK(湘)2016-0002。

1.1.3 飼料配方

高脂高糖飼料：參照《保健食品檢驗與評價技術規范-輔助降血脂功能評價方法》（2012年修訂），配方為基礎飼料63.6%、蔗糖20.0%、豬油15.0%、膽固醇1.2%、膽酸鈉0.2%。

1.2 儀器與試劑

試劑：總膽固醇（Total cholesterol，TC）、甘油三酯（Triglyceride，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（Low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（High density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、谷丙轉氨酶（Alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉氨酶（Aspartate transaminase，AST）以上試劑購自上海科華生物工程股份有限公司；谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）試劑盒購自南京建成生物工程研究所；血脂康膠囊購自北京北大維信生物科技有限公司。

儀器：MIKRO 22R冷凍離心機（德國Hettich公司）、TBA-40FR全自動生化分析儀（日本東芝公司）、Modulyod-230冷凍干燥機（美國Thermo公司）、DM2000生物顯微鏡（德國Leica公司）、Thermo Scientific Varioskan Flash酶標儀（美國Thermo公司）、UV-2550紫外分光光度計（日本Shimadzu公司），AEU-210湘儀電子天平（長沙湘儀天平儀器公司）、F6/10超細勻漿機（德國FLUKO公司）、解剖器械等。

1.3 試驗方法

1.3.1 茶樣干粉制備

取適量六堡茶樣品，按料液比1∶10，浸提3次（沸水），每次浸提時間為20?min，紗布過濾，合并浸提液，減壓濃縮至一定體積，于–20℃預凍12?h，放入冷凍干燥機干燥24?h，收集茶粉，密封包裝，–20℃保存。

1.3.2 主要成分指標測定

茶葉中主要成分指標測定參照GB/T 8313—2008《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》、GB/T 8302—2002《茶水浸出物測定》、GB/T 8314—2002《茶游離氨基酸總量測定》、GB/T 8312—2002《茶咖啡堿測定》；可溶性糖測定參照文獻[4-5,9]：蒽酮比色法；茶色素的測定參照文獻[22]：系統分析法。

1.3.3 動物模型構建及分組給藥

參考已有研究建立本試驗動物模型及分組給藥[8, 12, 23]。KM小鼠經適應性喂養7?d后，對體質量偏差較大的小鼠進行初步剔除后的60只小鼠隨機分為6組，每組10只，即模型組、正常組、陽性組及六堡茶的低、中、高劑量干預組。正常組給予基礎飼料，其他組給予高脂高糖飼料。采用脂代謝紊亂預防模型，同時給藥與喂食，六堡茶的低、中、高劑量處理組每日分別給予灌胃158、316、632?mg·kg-1茶葉水提物。劑量選擇[9, 24-25]：選擇茶葉人體推薦量（成人60?kg每日飲用10?g干茶，即166.7?mg·kg-1）的5、10、20倍為給六堡茶的低、中、高劑量濃度。因此，每只小鼠每日給予茶粉（茶葉水提物凍成干粉）劑量（mg·kg-1）=166.7×倍數×浸提率。陽性藥物組給予每日灌胃137?mg·kg-1血脂康，陽性藥成人（60?kg）每日推薦劑量為15?mg·kg-1，換算為小鼠的劑量（小鼠等效劑量相當于人的9.1倍），即為137?mg·kg-1。正常對照組和模型對照組均給予灌胃等量蒸餾水。每只小鼠按0.01?mL·g-1的容量灌胃，每天灌胃1次，連續35?d，每周稱體質量1次。

1.3.4 樣品的采集及制備[9,12,26]

（1）血清的制備：最后一次給藥后禁食不禁水24?h，麻醉后摘眼球取血，放入離心管中，4℃下靜置一段時間后，在4℃下3?000?r·min-1離心15?min，離心后取血清待測各項指標。

（2）肝組織勻漿制備：取出肝組織，在冷的生理鹽水中漂洗，除去血液，用濾紙拭干后稱量。稱取約0.2?g肝組織加生理鹽水，用細胞破碎儀制備10%肝勻漿液。4℃下3?000?r·min-1離心10?min，離心好后用移液器取上清液。分裝貯存于–80℃冰箱備用。

（3）小鼠肝臟和脂肪組織病理切片制備：分別取小鼠同一部位肝臟組織和睪丸周圍脂肪組織，于10%福爾馬林液固定，固定后經流水沖洗數小時。制備石蠟切片，HE染色，顯微鏡下拍照觀察。

1.3.5 血清與肝勻漿液中指標檢測

血清TC、TG、HDL-C、LDL-C、ALT及AST均采用全自動生化分析儀檢測，肝勻漿中MDA、SOD及GSH-Px含量根據試劑盒要求進行檢測。

1.3.6數據處理與分析

2 結果與分析

2.1 不同陳化年份茶樣的主要化學成分測定結果

本試驗選取了4個陳化年份（1、5、10、15年）的六堡茶樣品進行主要化學成分分析，結果如表1所示，4個不同年份的六堡茶主要化學成分，隨著陳化年份的推移，其水浸出物、茶多酚、游離氨基酸、茶黃素（TFs）、茶紅素（TRs）和可溶性糖含量呈現減少趨勢；咖啡堿和茶褐素（TBs）的含量呈現先上升后下降趨勢，5年份茶樣的咖啡堿和茶褐素含量最高。與陳化1年茶樣相比，5年份茶樣只有茶褐素的含量變化達到顯著水平（<0.05）；10年份茶樣只有茶多酚、茶紅素和茶褐素的含量變化達到顯著水平（<0.05）；而15年份茶樣測定的所有化學成分含量都急劇下降，除茶褐素外其他成分都達到顯著水平（<0.05 或<0.01）。此外，六堡茶隨著陳化時間的增加，(TFs+TRs)/TBs比值呈現不斷減小的趨勢，表明在陳化過程中TRs和TFs會大量的轉化為TBs。根據已有研究指出黑茶調節脂質代謝的物質基礎主要是茶多酚、茶褐素、茶多糖等[27]，同時鑒于陳化15年的六堡茶樣與年代較近的茶樣在內含物質成分（調脂功效的主要物質）含量上的顯著差異，為了驗證其是否仍然有很好的調脂護肝功效，故15年茶樣被選作陳年六堡茶代表用于后續試驗。

2.2 陳年六堡茶對小鼠體重與肝臟指數的影響

結果如表2所示，高脂模型組的終體質量、肝質量以及肝系數值都極顯著（<0.01）高于正常組小鼠。然而，六堡茶水提物各劑量組的小鼠終體質量、肝質量及肝系數值全面降低且呈劑量依賴關系，尤其高劑量組所有指標變化均具有統計學意義（<0.05或<0.01），說明陳年六堡茶水提物能有效控制小鼠體重、肝重增加以及肝系數的增大。

Table 1 Contents of main chemical compositions in Liupao tea of different storage ages

注：與1年茶樣比較：*<0.05，**<0.01。Note: Compare to tea sample produced for one year: *<0.05, **<0.01.

表2 陳年六堡茶對小鼠體重、肝重及肝臟指數的影響（，n=10）

注：與正常組比較：#<0.05，##<0.01；與模型組比較：*<0.05，**<0.01。下表相同。

Note: Compare to normal control:#<0.05,##<0.01. Compare to model control: *<0.05, **<0.01. The same below.

2.3 陳年六堡茶對小鼠血脂的影響

陳年六堡茶對小鼠血清血脂水平的影響見表3所示。模型對照組小鼠TG、TC、LDL-C含量極顯著（<0.01）高于正常對照組，而HDL-C含量極顯著下降（<0.01），表明本試驗采用的高脂高糖飲食方法使小鼠呈現了高脂血癥狀。而與模型組相比，給予低劑量陳年六堡茶對小鼠血清TG、TC、LDL-C和HDL-C水平有改善作用，但沒達到顯著水平（>0.05）；給予中劑量陳年六堡茶小鼠血清TG和LDL-C水平顯著降低（<0.05）；而高劑量組小鼠血清中TG、TC、LDL-C和HDL-C含量均達到顯著差異（<0.05）且LDL-C和HDL-C含量接近正常組水平。這些結果表明陳年六堡茶尤其高劑量條件能有效調節小鼠的脂質代謝平衡。

2.4 陳年六堡茶對小鼠血清肝功能指標的影響

谷草轉氨酶（AST）和丙氨酸轉氨酶（ALT）是肝功能的主要指標，檢測AST、ALT的活性來反映肝組織實質受損程度。結果見表4，與正常對照組相比，模型對照組小鼠血清ALT、AST活力均極顯著升高（<0.01）。與模型對照組相比，給予陳年六堡茶水提物后，低、中、高3個劑量組的小鼠血清ALT和AST活性均有下降且呈劑量依賴關系，尤其中劑量條件下AST活性變化達到顯著水平（<0.05），高劑量條件下ALT和AST活性均顯著下降（<0.05或<0.01）。由此可推斷，陳年六堡茶能改善高脂血癥模型小鼠的肝功能，可減輕肝臟組織受損程度。

表3 陳年六堡茶對小鼠血脂水平的影響（, n=10）

表4 陳年六堡茶對小鼠血清中ALT和AST活力的影響（, n=10）

2.5 陳年六堡茶對小鼠肝勻漿抗氧化指標的影響

結果顯示（表5），與正常對照組相比，高脂模型組肝勻漿中MDA的含量極顯著升高（<0.01），SOD和GSH-Px活力極顯著下降（<0.01），表明高脂高糖飲食使小鼠肝臟處于較強的氧化應激狀態。與模型對照組相比，給予陳年六堡茶水提物后，低、中、高3個劑量組的小鼠肝勻漿MDA、SOD和GSH-Px含量均有改善且呈劑量依賴關系，尤其中劑量條件下MDA含量顯著下降和SOD活性顯著上升（<0.05），高劑量條件下MDA含量顯著下降和SOD、GSH-Px活性顯著上升（<0.05或<0.01）。這些結果表明陳年六堡茶可以通過提高肝細胞中SOD、GSH-Px活力改善肝臟氧化應激狀態和抵抗機體脂質過氧化。

表5 陳年六堡茶對小鼠肝臟抗氧化指標的影響（, n=10）

2.6 陳年六堡茶對小鼠肝組織形態的影響

圖1可以看出，正常對照組小鼠肝臟質韌，色澤均勻，顏色暗紅；模型對照組小鼠肝臟體積明顯增大，質脆，呈土黃色；而陳年六堡茶各劑量組尤其高劑量組較模型組小鼠肝臟體積有所減小，質韌，色澤略偏紅。HE染色顯示（圖2），正常對照組小鼠肝竇結構清晰，肝細胞大小較一致，肝細胞索排列整齊，細胞核清晰、胞漿均勻。高脂模型組肝組織結構異常，肝細胞索排列紊亂，肝竇縮小甚至消失，肝細胞變大有明顯的脂滴蓄積并伴有腫脹現象，細胞核位于細胞中央，胞漿呈空泡狀。與模型對照組相比，灌胃低、中、高3個劑量陳年六堡茶后，試驗小鼠肝細胞損傷程度有不同程度的改善且呈劑量依賴趨勢，特別是中、高劑量組小鼠肝細胞索排列較整齊，細胞間界限較清晰，炎癥細胞浸潤減輕，肝細胞變性及腫脹程度降低，脂滴蓄積明顯減少甚至消失，已基本接近陽性對照組水平（圖2）。這些結果進一步表明陳年六堡茶能明顯抑制高脂飲食引起的肝臟病變的作用，有效減少小鼠肝臟的脂肪堆積及減輕肝損傷情況。

2.7 陳年六堡茶對小鼠脂肪組織形態的影響

如圖3所示，與正常對照組相比，模型對照組小鼠脂肪細胞形態不規則，細胞明顯膨大，脂肪細胞內充滿脂滴。與模型對照組相比，通過灌胃給予陳年六堡茶水提物后，低、中、高3個劑量組的小鼠細胞直徑均有所減小，同一視野范圍內脂肪細胞數量增加，且隨著灌胃劑量的增大，改善效果越明顯，特別是受試茶樣高劑量組小鼠脂肪細胞大小基本接近于陽性對照組甚至正常對照組水平。這些結果提示陳年六堡茶能抑制脂肪細胞膨大和減少脂肪細胞內脂肪的累積。

3 討論

已有研究[20]指出：六堡茶在陳化過程中（1~7年），隨陳化年份的推移其茶多酚、氨基酸、水浸出物、茶黃素（TFs）及茶紅素（TRs）等物質呈逐漸下降的趨勢；茶褐素（TBs）隨著陳化年份的遞增得到積累，呈上升趨勢；咖啡堿在陳化過程中呈波動性變化，總體變化不大。本研究中，我們選取了陳化時間跨度更大的幾個茶樣（1、5、10、15年），試驗結果與上述結果基本保持一致；但是TBs的含量呈現先上升后下降趨勢，陳化5年的茶樣TBs含量最高，15年最低。這些結果表明六堡茶在后發酵的陳化過程中，TFs、TRs的量在前期一段陳化時間內茶色素變化總趨勢下降，而TBs的量得到了積累；當后發酵的陳化時間過長后TBs也會發生進一步轉化或分解，如生成一些不溶性物質[28]，導致TBs含量明顯下降。同時，我們也發現了(TFs+TRs)/TBs隨著陳化時間的增加呈現不斷減小的趨勢，表明在陳化過程中TRs和TFs會大量的轉化為TBs，這也與普洱茶在陳化過程中的變化趨勢基本一致[17,29]，這個指標可能可用作評判六堡茶陳化時間長短的一個標準。

圖1 小鼠肝臟照片

圖2 小鼠肝臟組織病理形態變化（200×）

圖3 小鼠脂肪組織病理形態變化（200×）

六堡茶作為黑茶家族中的一員，降脂減肥保肝作用同樣是其最重要的一類功能；已有文獻[14-16]表明了其在調脂保肝方面的作用，但是一般采用的都是年代比較新的茶樣；而六堡茶隨著陳化時間的增加，特別是長時間陳化，其目前已知主要內含物質成分都在減少。為探討有“越陳越好”品質的六堡茶是否還具有調脂保肝效果，本研究通過對4個陳化時間（1、5、10、15年）的茶樣的主要化學成分含量比較分析，選取了與年代較新的茶樣在內含物質成分含量上有顯著變化的15年茶樣作為陳年六堡茶的代表，用于后續動物試驗。結果發現，陳年六堡茶能夠改善高脂血癥小鼠的生理生化指標，尤其在中、高劑量條件下也就是小鼠對應人體推薦劑量的等效劑量和2倍等效劑量條件下能達到顯著水平（<0.05）。肝臟和脂肪組織病理切片顯示，陳年六堡茶能減少肝細胞中脂滴的形成和抑制脂肪細胞膨大及脂肪的累積，呈劑量依賴關系。由于脂肪細胞大小以及脂肪組織累積的程度表現出與體重獲得正相關，從而陳年六堡茶的攝入也表現出有效地控制試驗小鼠的終體質量。綜上表明，陳年六堡茶在正常劑量條件下能有效改善因高脂高糖飲食所致的小鼠脂質代謝紊亂和肝臟損傷。

陳智雄等[27]認為，年份黑茶的調節脂質代謝物質基礎主要是茶多酚、茶褐素、茶多糖等物質以及微生物的代謝產物。已有研究指出，普洱茶中的微生物如土曲霉（）等可產生有降血脂作用的洛伐他汀[30]，茯磚茶的優勢菌種冠突散囊菌（）中也含有洛伐他汀[31]，六堡茶優勢真菌種群是曲霉菌屬（）和散囊菌屬（）[32]，但目前六堡茶微生物代謝產物降血脂方面的研究還未見報道。根據普洱茶中的土曲霉和茯磚茶的冠突散囊菌分別是曲霉菌屬和散囊菌屬的一種，六堡茶那些微生物的代謝產物也可能有降脂的作用成分，也就是說陳年六堡茶的兒茶素、茶褐素、茶多糖等物質以及微生物的代謝產物，甚至還有目前未知的陳化分解的新化合物一起構成了調節脂質代謝物質基礎。

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Alleviative Effects of Aged Liupao Tea on Lipid Metabolism and Liver Injury in Hyperlipidemic Mice

WU Wenliang1,2,3,4, LIU Zhonghua1,2,3*, LIN Yong1,2,3*, HUANG Jian′an1,2,3, ZUO Gaolong1,2, TENG Cuiqin5, LONG Zhirong6, QIU Ruijin5, CAO Zhonghuan5

1. Key Lab of Tea Science of Education Ministry, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 2. National Research Center of Engineering Technology for Utilization of Botanical Functional Ingredients, Changsha 410128, China; 3. Collaborative Innovation Center of Utilization of Functional Ingredients from Botanicals, Changsha 410128, China; 4. Tea of Institute, Hunan Academy of Agricultural Sciences, Changsha 410125, China; 5. Wuzhou Academy of Liupao Tea, Wuzhou 543003, China; 6. Wuzhou of Office Tea Industry Development, Wuzhou 543003, China

To investigate the alleviative effects of aged Liupao tea on lipid metabolism and liver injury in hyperlipidemic mice, the changes of main chemical substances in Liupao tea of different storage ages were analyzed.The hyperlipidemia model mice were established by feeding a high fat and sugar diet, and Liupao tea groups were given daily oral administration of water extract of selected aged Liupao tea. The changes of related physiological andbiochemical indexes and tissue morphology in mice were observed. The results showed that Liupao tea samples stored for 15 years were selected as the representative of the aged Liupao tea, which was used in subsequent experiments. Compared with the hyperlipidemia model group, aged Liupao tea especially medium or high dose groups could significantly decrease the contents of TC, TG, and LDL-C levels, increase the content of HDL-C, suppressthe activities of ALT and AST in the serum, and moderate liver oxidative stress,. Pathological sections of liver and adipose tissue showed that aged Liupao tea could reduce the formation of lipid droplets in liver cells and inhibit the enlargement of fat cells in a dose dependent manner. In conclusion, aged Liupao tea of normal dose could effectively improve lipid metabolism disorder and liver injury in mice induced by high fat and sugar diet.

aged Liupao tea, hyperlipidemia, lipid metabolism, liver injury, alleviative effect

TS272.5+9

A

1000-369X（2018）04-430-09

2017-12-12

2018-01-30

梧州市科學研究與技術開發計劃項目（201501028），2015年梧州市六堡茶產業化項目，國家茶葉產業技術體系崗位科學家項目（CARS-23）、湖南省自然科學基金項目（2017JJ3106）

吳文亮，男，在讀博士研究生，主要從事茶葉加工及茶葉功能成分化學研究。*通訊作者：larkin–liu@163.com