基于3D打印的血型檢測微流控芯片研究

許 雪， 陳 曦， 趙佳敏， 張自力， 李永猛

(河北工業大學人工智能與數據科學學院，天津 300130)

0 引 言

隨著大數據時代的到來，臨床血型即時檢測工作日益繁重。匹配錯誤會導致嚴重后果，因此必須保證獻血與輸血間血型的一致性。微柱凝膠檢測法[1]是目前國際衛生組織特別推薦的方法，較之傳統玻片法、試管法，其靈敏度可提高10倍以上，結果穩定便于檢測。微流控芯片技術具備微量、高通等特點，可實現在微升級別上的集成分析以及各項操作與功能[2]，檢測過程易實現自動化、批量化、高效化、精度化，被廣泛用于醫學檢測、基因分析、細胞篩選等眾多領域[3-4]。為提高檢測精度，對使用的微流控芯片具有較高的要求。然而，微流裝置的微細加工需要昂貴的實驗室設備，雖然存在相對便宜的制造技術，如聚合物基（PDMS）微細加工，其利用模具的光刻制造來制備芯片，微流通道開放，并需要熟練的專業人員。此外，紙基微流控芯片或試紙對環境條件敏感，且需要實驗室條件進行批量生產，耗時耗力。而一臺3D打印機，可將多步驟集成到一個按鈕中，能達到快速制備一張密閉高通流道微流控芯片的目的，通道更安全、可靠。同時，微流控芯片需要相對精確的3D打印，而現有大部分3D打印機中，FDM（熔融沉積型）精度不夠，SLA（光固化）精度達到，但價格較高。液晶掩模（LCD masking），能即時打印，但缺點是LCD屏易損易老化，可選范圍少，成本相對較高。因此，本文采用目前流行的一種基于面投影，逐層光固化的高精度數字光處理（digital light processing，DLP）3D打印技術，采用微升級工藝進行微流控芯片的制備。較傳統制備方法，速度更快，通道精度更高；通道密閉，安全性能更好，同時相對于LCD成本更低，選擇范圍更廣，能滿足對血型的快速即時檢測要求。

3D打印技術制造方法便捷，同時擁有較高精度，已有很多研究將其應用于微流控芯片的加工中[5]。如Spivey等[6]使用基于DLP技術的3D打印機加工了用于研究細胞衰老的微流控芯片，精度可達4 μm。然而，3D打印與醫學診斷芯片相結合的應用還沒有得到很好地探索，尤其對于微升級3D打印微流控芯片的制備，在速度和精度方面還有待發展。因此，設計研究一種密閉微通道的用于血型檢測的3D微流控芯片很有必要。

1 方 法

1.1 DLP（數字光處理）3D打印技術

數字微鏡裝置的數字光處理（DLP）3D打印技術，較傳統的微立體光刻技術，打印速度和準確度進一步提高[5]。DLP工作原理，如圖1所示，在3D打印過程中，激光照射到一個由MEMS技術加工而成的微鏡陣列上，通過微鏡陣列對激光反射的控制（陣列角度±10°）達到選擇性曝光光刻膠的目的，通過面成型代替點成型，光強分布均勻，穩定性強，同時可以達到工業級精度，大幅度減少打印時間，提高效率。

圖1 DLP 3D打印技術工作原理

在3D打印微流控芯片過程中，激光對光敏樹脂進行曝光固化的同時，調節升降臺高度，采用下投影式，可動態地創造出每一層的光學圖案，逐層打印，如圖2所示，進而實現對整個3D微流控芯片的制備加工。

圖2 3D打印下投影式成型機原理圖

1.2 芯片的設計與制作

本文設計的血型檢測微流控芯片，使用桌面級3D打印機，直接將三維設計軟件AutoCAD的數字模型（輸出為stl格式文件），通過計算機轉換為特定厚度的截面數據，導入打印機，如圖3所示。實現芯片的制備，降低了人為因素誤差，更安全可靠。

圖3 微流控芯片打印流程圖

制備的微流控血型檢測芯片如圖4所示，尺寸為34 mm×33 mm×4 mm（長×寬×高）。

圖4 血型檢測微流控芯片概念圖及實物圖

1.2.1 芯片微通道反應腔結構

芯片的主要部分即微流道反應腔，該3D微流控芯片由6個規格相同的密閉微流通道反應腔（簡稱微流道）構成，分別為抗A、抗B、抗Rh（D）、對照A、B、D。該微流道灌裝容積約為9 μL，要求灌入到血型卡每個微柱內藥液均為7 μL。流道總長16 mm，從采樣通道端口到入口儲液池呈階梯狀，長度分別為4 mm，7 mm，5 mm，寬度分別為0.5 mm，1 mm，1.5 mm，深度分別為0.3 mm，0.5 mm，0.7 mm，每個單通道平面構型設計如圖5所示，包括入口儲液池、試劑反應腔、采樣通道3個主要模塊[7]，芯片微流道結構設計三維示意圖見圖6。

圖5 芯片單通道平面構型圖

1.2.2 微流控芯片的制備

本文使用DLP的3D打印機（閃鑄Hunter），通過直接將AutoCAD數字設計導入打印機，創建單個血型檢測微流控芯片，從而實現概念到芯片的制造。該項目所需材料還包括3D打印的耗材透明樹脂，氫氧化鉀（KOH），乙二醇，過氧化氫。打印完成后，用異丙醇清洗3D芯片，并用空氣壓縮機沖洗未固化的樹脂[8]。為了增大芯片材料的親水性[9]，進一步提高微通道質量，用0.1 mol/L KOH溶液活化樹脂，再將3D打印的微流控芯片浸入含有1.82 mol/L KOH的純乙二醇溶液中，在60℃下孵育2 h[9]，最后用水沖洗芯片，得到最終用于血型檢測的微流控芯片。

圖6 芯片微流道結構示意圖（單位：mm）

1.3 微流控芯片檢測識別

1.3.1 檢測原理

基于微柱凝膠技術，采用正定型的方法進行檢測，通過一次工序，在芯片入口儲液池灌入體積比為3:2的葡聚糖凝膠與抗體的膠液混合物，其凝膠介質在50倍顯微鏡下如圖7所示。

圖7 凝膠型介質顯微示意圖

加入樣本血液（每微通道約1 μL），采用離心機進行高速離心2 min。通過圖像識別微流管道內紅細胞凝集停留位置（如圖8所示）：抗原抗體發生凝集時，凝集的紅細胞停留在分離介質上層（+），為陽性反應；未發生凝集反應的，所有紅細胞通過分離介質間隙，在微流道底部聚集（-），為陰性反應。最終，得到需要檢測的對應血型。

圖8 微流道凝膠抗體與紅細胞抗原示意圖

1.3.2 檢測流程

采用實驗室攝像機（型號：MV-EM200C，S/N：00464658），對微流控芯片進行拍攝。圖9（a）、圖9（c）為以LED為背光，紅色光源攝像頭照射下的芯片通道實物圖。

將采集到的原始六通道圖像進行剪裁，得到芯片單通道圖像，對圖像進行灰度化、噪聲濾波，并進行二值化處理得到二值圖，再通過Sobel算法[10]進行邊緣處理（見圖9（b）），拾取反應區形狀特征，采用質心法得到質心標記圖（如圖10所示），以便更好地對血型檢測結果進行自動識別。最后，通過識別二維碼對微流控芯片進行記錄，具體步驟如圖11所示。

2 結果與分析

3D打印質量通過微觀結構的掃描電子顯微鏡（SEM）成像來表征[7]，圖9（d）為3D打印的微流控芯片微通道SEM圖，顯示打印圖層細節（400 μm）。通過測試，血型檢測微流控芯片滿足實驗要求。

2.1 芯片灌裝高度

采用微柱凝膠血型檢測法，對芯片微流道中試劑體積有嚴格要求，試劑過多或過少都會影響檢測結果。因此灌裝后需檢測芯片的膠液混合相高度是否符合標準。

圖10 質心標記圖

圖11 血型檢測處理流程圖

在已有數據中，選擇了400張灌裝后芯片進行高度測量。表1是部分芯片膠液混相高度數據。其中N為芯片序號，1-i為第1張卡的第i個（1≤i≤6）微柱管；M1為手工測量的膠液混相高度；P1為Sobel算法檢測得到的膠液混相高度；誤差E1=P1-M1；t為單張微流控芯片六微柱管高測量總耗時。

對2 000張所有采集的膠液混相高度誤差數據作誤差數據直方圖并擬合分布曲線進行分析，如圖12所示，由圖像曲線可看出其分布近似于正態分布。

所以誤差概率密度函數可表示為

式中 μ為均值， σ為標準差。近似計算可得，μ=?0.0401，σ=0.0401。由 3σ原則知，數值分布在(μ?3σ,μ+3σ)中的概率為0.997 4，超出這個范圍的可能性不大于0.003，因此可以近似認為膠液高度誤差在（–0.160 4，0.080 2）區間內，符合膠液高度測量的精度要求。即3D打印的微流控芯片，通道打印均勻，質量符合精度要求。

表1 血型檢測微流控芯片微柱高度測量數據

圖12 膠液混相高度誤差分布（n=2 000）

2.2 芯片血型識別

在微流控芯片中灌入7 μL葡聚糖凝膠與抗體膠液混合試劑，進行獨立重復血型檢測實驗[11]。人工手動識別作為對照實驗記為A，微流控芯片圖像識別記為B，實驗樣本分別取A組（1 182片）、B組（1 409片）。其中，人工識別采用傳統方法進行滴定識別，而微流控芯片的血型檢測，通過圖像處理進行識別，血型檢測識別結果見表2。

數據統計結果顯示，微流控芯片圖像識別，可在1 200 ms左右完成單樣品圖像檢測，單張整體耗時3 min左右，較臨床實際需求的5～20 min耗時較短，且樣品識別率提高至99.29%。

表2 微流控芯片血型檢測樣本識別

3 結束語

本文采用基于DLP的光固化3D工藝技術，設計制備了一種用于快速檢測血型的微流控芯片，利用該微流控芯片，對人體血液進行采樣檢測實驗，并對血型檢測結果進行分析。結果表明該芯片成功檢測出樣品血型種類，且檢測成功率較高，整個過程耗時較短，具有易于操作、成本低、試劑消耗少、快速即時檢測等特點。結合二維碼等智能手段，為個性化智慧醫院[12]的建立提供新的檢測基礎。本文對芯片的3D打印方法具有通用性，對打印復雜幾何結構的微流控芯片，均具有適用性。