山東地區漢族女性ER β基因多態性與橋本病相關性研究

張金華，佟愛華，柳 林，徐方江，于鳳泉

慢性淋巴細胞性甲狀腺炎，又通稱橋本?。℉ashimoto disease，HD），是常見的自身免疫性甲狀腺疾病 （autoimmune thyroid diseases，AITD）之一，其發生與發展是環境因素、自身免疫與遺傳因素共同作用的結果，其中遺傳因素約占30%左右［1］。ER β基因的5號內含子啟動區域有C和A短串聯重復序列（short tandem repeat，STR），其重復序列的多少與人某些疾病的發生與發展有關［2］。該研究通過分析ERβ基因（CA）n多態性在山東漢族女性HD患者中的分布頻率，以期為AITD患者積累更多的遺傳學資料。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年1月—2015年12月在臨沂市中心醫院內分泌科門診就診及住院的山東漢族女性HD患者資料100例，年齡21～44歲，平均（34.29±7.34）歲。另選擇100例該院同期健康查體漢族女性，年齡 20～46 歲，平均（35.72±6.81）歲，所有入選者均行甲狀腺功能、甲狀腺相關自身抗體及甲狀腺彩超檢查，均排除甲狀腺疾病；均無自身免疫性疾病及相關家族史。

1.2 納入及排除標準 所有HD患者均檢測甲狀腺功能：游離三碘甲腺原氨酸（FT3）、游離甲狀腺素（FT4）、促甲狀腺激素（TSH）；甲狀腺相關抗體：甲狀腺過氧化物酶抗體 （TPOAb）、甲狀腺球蛋白抗體（TGAb）和促甲狀腺激素受體抗體（TRAb）以及甲狀腺彩超檢查。參考2007年柳林［1］等及2007版中國甲狀腺疾病診治指南嚴格入選與排除。

1.3 ERβ基因檢測方法

1.3.1 全血DNA抽提 2%EDTA抗凝，靜脈血抽提基因組 DNA（200 μl）（按照上海生工全血基因抽提試劑盒說明書進行操作），溶于60 μl TE中，-20℃儲存。

1.3.2 引物的設計與合成 參照2007年既往建立的方法［1］選擇引物。 上游引物：5’AACAAAATGTT GAATGAGTGGGG3’；下游引物：5’GGTAAACCATG GTCTGTACC3’。

1.3.3 PCR反應條件與體系 PCR反應條件：94℃變性 35 s，60℃退火 35 s，70℃延伸 35 s，30個循環后 70 ℃終延伸 10 min。 20 μl反應體系：DNA（2 μl），上下游引物（10pmol，各 1 μl），dNTP Mixture（10 mM，0.5 μl），MgCl2（25 mM，1.2 μl），Taq 酶 （5 U/μl，0.25 μl），ddH2O（20 μl）。

1.3.4 擴增產物測序 擴增產物為ERβ基因CA重復序列一段長約150～200 bp的基因片段（上海生工測序分析）。

1.4 統計學方法 分別計算對照組和HD患者基因型的頻率。基因型頻率和構成比比較應用χ2檢驗，以優勢比（OR）和95%的可信區間（CI）表示相對風險度。所有數據均應用SPSS 19.0統計軟件包分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ERβ基因CA重復序列的等位基因在對照組和病例組分布 分析比較發現，（CA）n基因型等位基因分布頻率在兩組中不同，但無統計學差異（χ2=3.852，P=0.870）。 見表1。

表1 ERβ（CA）n基因型在對照組和病例組的分布

2.2 CA重復序列構成在比對照組和病例組中的比較 等位基因型（CA）20在兩組均占最大比例，按照復次數n≤20為S型，n＞20為L型的原則，病例組L型構成比（37%）小于對照組（49%）；S型構成比（63%）大于對照組（51%）。兩組構成比差異無統計學意義（χ2=2.938，P=0.087）。 見表2。

表2 對照組和病例組CA-STR構成比比較

3 討論

基因多態性是指一個基因位點上存在一種以上的等位基因，其重復次數在人群中高度變異，這種變異的串聯重復序列決定了DNA長度的高度變異性［3］。ERβ 基因（CA）n重復序列多態性，其重復次數的不同與人體某些激素水平和一些疾病的發生有關。國內外有學者初步研究發現，ER基因多態性與某些自身免疫性疾病，如類風濕性關節炎［4］、系統性硬化?。?］、系統性紅斑狼瘡［6］的發生發展存在相關性。然而Ban［7］研究發現，ER基因多態性與AITD無關。目前，國內仍未見類似報道。

AITD為多基因遺傳病，導致其發病的易感基因是多個單核苷酸基因多態性共同作用的共同結果。 既往研究發現，人類白細胞抗原 II（HLA-II）［8］，蛋白酪氨酸磷酸酶非受體 22（PTPN22）［9］、細胞毒性T 淋巴細胞抗原 4（CTLA-4）［10］，白細胞分化抗原 40（CD40）［11］，信號轉導子及轉錄激活子 4（STAT4）［12］，以及甲狀腺特異基因［13］均與AITD相關。然而，國內外研究至今未發現針對AITD的主效易感基因。

該研究結果顯示，病例組和對照組CA重復序列等位基因型分布頻率差異亦無統計學意義 （χ2=3.852，P=0.870）；等位基因（CA）20在兩組構成比中占比例最大，病例組S基因型構成比（63%）大于對照組 （51%）；L基因型構成比 （37%）小于對照組（49%）。兩組構成比差異無統計學意義（χ2=2.938，P=0.087）。由此提示，HD的發病與ERβ的CA重復序列多態性尚無關聯。前期筆者研究發現［14］，雌激素β受體基因CA重復序列多態性與GD的發病有關，S基因型個體易于發生GD。國內尚無此研究，因此該研究結論的得出在部分上為群體遺傳學研究積累了部分相關資料。

綜上所述，AITD的發生是環境因素、遺傳因素和免疫因素共同作用的結果，ERβ基因多態性與許多自身免疫性疾病存在相關性。鑒于該研究的局限性，ERβ基因 （CA）n多態性與HD的遺傳易感性需要擴大樣本例和地域人群后更深入研究，從而為AITD的基因遺傳學積累更多資料。