一株耐鉛土著微生物的吸附特性及機制研究

張 敏，郜春花，李建華，盧晉晶，靳東升，郜雅靜

（1.山西大學生物工程學院，山西 太原 030006；2.山西省農業科學院農業環境與資源研究所，山西 太原 030031）

土壤作為生態系統的重要組成部分，是農業可持續發展的基礎，它養育著地球上一代又一代的人類，但目前面臨著各種威脅，其中，土壤污染最嚴重，土壤污染破壞生態系統穩定，影響人類健康，是危害全球環境質量的重要問題之一，是人類目前必須重視并解決的問題。山西省作為我國重要的工業基地，因采礦和工業制造導致的土壤重金屬污染問題十分嚴重，其中鉛污染尤為突出[1-3]。鉛作為一種有毒重金屬，土壤中過量的鉛積累會改變土壤性質，導致土壤養分元素供應減少、肥力降低、土壤微生物的多樣性減少[4-6]，還可進入作物體內，阻礙作物生長發育，降低作物的品質，并通過食物鏈進入人體，對人體健康產生潛在危害[7-8]。

目前，土壤重金屬污染的修復研究是國內外研究的熱點[9-13]，與以往重金屬污染治理的物理、化學修復相比較，生物修復費用低、效果好，不會或很少造成二次污染[14]，其中，微生物修復已成為當今環境科學研究領域的熱點，而微生物-植物聯合修復更是具有挑戰性的研究方向之一[15]。微生物修復或微生物-植物聯合修復的首要任務就是獲得新的具有極高耐受性和吸附效果的微生物菌株。細菌作為微生物中的最大群體，在微生物修復領域占主要地位，目前研究主要集中在細菌對重金屬的吸附性、耐受性以及作用機制等方面[16]。但是，由于微生物的地域性與多樣性，同一地域、不同種類微生物或不同地域、同一種類微生物的生長條件、內部細胞結構差異較大，與重金屬相互作用過程相當復雜，作用機理的研究還不夠清晰，未形成統一的理論與標準[17-18]。因此，微生物吸附特性與機制的研究具有極大的科研價值。

本試驗以前期篩選出的耐鉛菌株GDYX03（Enterobacter ludwigii）為研究對象，尋求其最佳吸附條件，構建吸附動力學與吸附等溫模型對其吸附行為進行分析，利用透射電鏡與紅外光譜儀對菌株吸附的內在機制進行初步研究，探討菌株對重金屬鉛的吸附機制，為后期重金屬鉛污染生物修復的實際應用提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 菌種來源

菌株GDYX03篩選于太原市小店區疙瘩營（污水處理廠）土壤，經鑒定為腸桿菌屬（Enterobacter ludwigii）。

1.2 吸附特性與機制研究

1.2.1 不同條件對菌株吸附Pb2+能力的影響

1.2.1.1 菌體的制備 將耐鉛菌株GDYX03在土豆葡萄糖液體培養基的優化生長條件下培養至最佳吸附狀態，4 000 r/min離心20 min，用去離子水清洗菌體，繼續離心，反復3次，收集菌體活細胞。

1.2.1.2 吸附試驗 將收集到的菌體活細胞制成定量菌懸液，取適量于20 mL含Pb2+水溶液的小三角瓶（50 mL）中，在設置的各參數下吸附后，17 000 r/min離心5 min，取上清液測定Pb2+的濃度，每個試驗做3個重復，每組均以不加菌體組為對照。

1.2.1.3 Pb2+濃度的測定 采用原子分光光度計測定Pb2+的濃度，計算公式如下。

1.2.1.4 活細胞吸附方式的選擇 按10%的接菌量將培養24 h的種子液接種于含Pb2+質量濃度為100 mg/L的液體培養基中，30℃，180 r/min培養于恒溫搖床中，以不接菌、含Pb2+質量濃度為100 mg/L的液體培養基為空白對照，測量生長菌株過程吸附的吸附效果，并與無營養物質提供的菌體活細胞吸附效果進行比較。

1.2.1.5 不同條件下耐鉛菌株對Pb2+吸附能力的研究 以菌齡（菌株培養時間）、溶液pH值、接菌量、吸附溫度、吸附時間和初始鉛質量濃度為單因素，檢測菌體在各種條件下對Pb2+的吸附效果。首先菌齡設定為 16，24，48，72，96 h，鉛質量濃度為100 mg/L，溶液初始pH值，接菌量5 g/L（干菌量），置于30℃搖床吸附2 h，離心收集上清液，采用火焰原子分光光度計測定，確定最佳菌齡，然后依次確定 pH 值（2，3，4，5，6，7.5）、接菌量（0.5，2.5，5，7.5，10 g/L）、溫度（20，25，30，35，40 ℃）和時間（5，10，30，60，90，120 min）的最佳值，最后研究初始鉛質量濃度（50，100，200，300，400，500 mg/L）的最佳值，以不接菌為對照。

1.2.2 吸附動力學 將含Pb2+溶液（500 mg/L）與一定量的菌懸液混合（接菌量為5g/L），30℃，180 r/min振蕩吸附，以不加菌體為對照，每隔一段時間取部分離心分離，測定上清液中Pb2+含量，直至其達到吸附平衡狀態。吸附動力學模型如表1所示，其中，qt表示時間t時菌體的吸附量，qe表示吸附平衡時菌體的吸附量，k1，k2，A，B為動力學模型參數[19]。

表1 吸附動力學方程模型

1.2.3 等溫吸附模型 配制不同Pb2+質量濃度的溶液（100，200，300，400，500 mg/L），加入一定量的菌懸液（接菌量為5 g/L），30℃，180 r/min振蕩吸附到平衡，以不接菌的含鉛溶液為對照，取上清液測定吸附平衡時的Pb2+質量濃度，并將試驗數據進行模型擬合。

1.2.4 透射電鏡與紅外光譜分析 收集吸附Pb2+前后的菌樣，樣品經固定、脫水、包埋、切片、染色等步驟，制備超薄菌株切片，置透射電鏡下觀察；將吸附Pb2+前后的菌體真空干燥，采用紅外光譜儀測定并記錄其光譜。

1.3 數據統計

采用Excel 2007對數據、圖表進行處理；采用SPSS 19.0對數據進行方差分析、回歸分析等，并采用Origin 8進行紅外光譜的繪制。

2 結果與分析

2.1 活細胞吸附方式的選擇

生物吸附包括活細胞和死細胞的吸附。本試驗的研究目的是篩選耐鉛菌株并用于土壤重金屬污染的生物修復，因此，本試驗適合以活細胞吸附為研究對象?；罴毎接址譃橛袪I養物質提供的生長菌株過程吸附和無營養物質提供的活細胞吸附。由圖1可知，隨著鉛離子質量濃度的提高，2種活細胞吸附效果均呈現下降的趨勢，生長菌株過程吸附均比無營養物質提供的活細胞吸附效果差，且生長菌株過程吸附作用時間較長。

研究菌株GDYX03的活細胞吸附方式發現，無營養物質提供的活細胞吸附比生長菌株過程吸附效果好，原因是生長菌株過程吸附中因其細胞受重金屬離子的毒害作用而影響其生長發育，其次后期營養物質的不足、生長環境的變化等多種不可控因素也會限制細胞的生長，從而影響其胞外吸附。而無營養物質提供的活細胞吸附雖然胞內積累會因沒有營養物質提供而受到影響，但大量前期培養好的菌體依舊可以通過表面吸附來去除重金屬離子，且其吸附效果較好，表明該菌株吸附作用以胞外吸附，即表面吸附為主，可能發生了表面絡合，或離子交換、靜電吸附，或表面微沉淀，或者多種機制共同作用[20-21]，其還有待進一步證實。

2.2 不同條件下耐鉛菌株對Pb2+的吸附能力

2.2.1 菌齡 由圖2-a可知，取斜面上一接菌環菌種于100 mL液體培養基中培養72 h離心所得菌體吸附效果最佳，吸附率為95.414%，吸附量為18.783 mg/g，隨著菌齡的升高或是降低，其吸附率與吸附量均減小，原因是菌體細胞壁膜的某些成分與含量隨菌株的生長而變化。陳志英等[22]研究了菌齡對菌株吸附銅離子能力的影響，結果表明，不同生長期的菌株對Cu2+吸附能力有顯著差異，其主要原因是細胞壁膜中磷脂和脂多糖的含量隨菌齡而變化，導致菌株吸附Cu2+的能力也隨菌齡而變化。因此，在其他相應條件下，菌株GDYX03培養72 h時，其細胞壁膜對Pb2+的吸附作用處于最佳狀態。

2.2.2 pH值 由圖2-b可知，pH值對菌株吸附Pb2+的影響較大，隨著pH值的增加，菌株吸附率由16.595%上升至98.366%；當pH值為6時，吸附率最高；當pH值高于7時，吸附效果開始降低。KIRAN等[23]和KAPOOR等[24]研究表明，溶液pH可通過影響菌株表面吸附位點的活性及重金屬離子的形態來影響生物吸附作用。pH較低時，大量的H+和H3O+與金屬離子競爭菌體表面的吸附位點，隨著pH值的升高，H+與細胞壁上的官能團分離，細胞表面更多帶有負電荷的官能團開始暴露，吸附位點增多，吸附效果增強，但當pH大于離子的微沉淀點時，溶液中鉛離子會形成Pb（OH）2沉淀，阻礙細胞表面部分載體的協助運輸，從而影響吸附效果，其結論正如ADNAN等[25]的研究。菌株吸附作用后，溶液pH值由原來的弱酸性變成弱堿性，說明菌株吸附過程會產生堿性分泌物，與鉛離子形成表面沉淀，該作用可能是菌株吸附的一個重要途徑。

2.2.3 接菌量 由圖2-c可知，隨著接菌量的增加，菌株對Pb2+的吸附率也隨之增加，但吸附量逐級減小，當接菌量達到5 g/L時，其吸附率達到最高，為98.318%，吸附量為19.73 mg/g，原因是隨著接菌量的增加，菌體表面的活性位點增加，從而與Pb2+充分接觸，達到較好的吸附效果，但當接菌量過量后，菌體易發生聚集現象，活性位點之間發生靜電排斥，不利于菌株對鉛離子的吸附，根據ACHARY等[26]和SELATNIA等[27]的研究，生物吸附量在很大程度上確實會受到吸附劑劑量的制約。BHAINSA等[28]的研究結果也表明，接菌量對菌株的吸附效果影響顯著，其作用機理與本研究看法相一致。但ZUMRIYE[29]則研究認為，由于菌體表面對Pb2+的結合位點強弱不同，菌體過多導致它們之間發生競爭吸附，使得結合位點不能夠充分利用而降低了吸附效果。綜合考慮吸附效果與菌株的利用率，最佳接菌量選擇5 g/L，這樣既可以有效去除重金屬離子，還可以降低操作成本。

2.2.4 溫度 由圖2-d可知，溫度對吸附作用有少量的影響，當溫度小于30℃時，吸附率與吸附量隨著溫度的升高而增大，其原因可能是菌株在吸附重金屬的過程中，溫度的升高為其在主動吸附過程中提供了所需能量，因而，提高了其吸附效果；而當溫度超過30℃時，吸附效果開始降低，因為高溫會影響菌體的正常代謝，且易破壞活性位點。FAN等[30]研究發現，某菌株吸附Pb2+時，溫度的變化會影響菌體對重金屬的親和力和其表面的吸附位點；黃飛等[20]研究也表明，溫度不僅可以影響重金屬離子與細胞表面官能團絡合物的穩定性，而且還可以通過改變細胞表面官能團的電離程度來影響吸附劑與重金屬離子之間的親和力，其作用效果與本研究相一致。因此，最終選擇菌株的最佳吸附溫度為30℃。

2.2.5 時間 從圖2-e可以看出，在初始質量濃度為100mg/L的溶液中，菌株吸附作用5 min時，吸附率達到88.288%，在30 min時，吸附率達到98.752%，因此，菌株吸附作用是一個非?？焖俚倪^程。VOLESKY[31]的研究也表明，吸附的初級階段是非常迅速的且不消耗能量。該菌株在吸附時間超過30 min時，吸附效果有少量的提升，說明該吸附作用還存在一種吸附方式，當吸附作用超過一定時間時，吸附效果開始有所下降，說明該作用過程中存在脫吸附現象。許旭萍等[32]研究發現，由于該吸附過程快速，且存在脫吸附現象，推測該菌株吸附機理可能主要是菌體表面吸附，但隨著時間的增加，還有少量鉛被菌體吸附，說明該吸附過程還存在少量的胞內積累。綜合考慮，最終選擇30 min為最佳吸附時間。

2.2.6 初始質量濃度 從圖2-f可以看出，在溶液中含Pb2+質量濃度為100 mg/L時，菌株GDYX03吸附效果最佳，吸附率和吸附量分別為98.852%和17.793 mg/g，分析是由于在低質量濃度Pb2+條件下，溶液中Pb2+與菌體表面吸附位點接觸率高，吸附效果好，當Pb2+質量濃度大到一定程度時，離子間的斥力增強，吸附位點處于飽和狀態，且有部分菌體裂解或自溶，導致吸附效果不佳。徐雪芹等[33]在研究菌株吸附廢水中Pb2+和Cu2+的機理中也證實，溶液中Pb2+的初始濃度對菌株吸附效果影響較大，原因是不同的初始濃度影響菌體表面吸附位點的活性，從而影響其吸附效果。綜合考慮，最佳初始質量濃度選擇100 mg/L。

2.3 吸附動力學分析

動力學用來描述吸附劑與吸附質作用的速率快慢，常常采用Lagergren一級動力學模型和Pseudo二級動力學模型來模擬其試驗數據，探討生物吸附機理和吸附過程[20]。本研究對菌株活細胞進行了幾種動力學方程的擬合，擬合結果列于表2。

表2 菌株吸附Pb2+動力學模型擬合

由表2可知，二級動力學方程擬合系數最高，R2為0.999，且通過對t/qt和t作圖（圖3-a），計算得到的 k2＝0.023 1，qe＝35.714，與實測平衡吸附量十分接近，說明二級動力學模型能夠較好地描述菌株的整個吸附過程[20]，與黃志鈞等[34]在研究抗銅離子菌株時的結論所一致。二級動力學方程揭示出菌株吸附過程包含多個步驟的反應，其可能是物理吸附，也可能是化學吸附，還可能是生物代謝型吸附[19]，因此，該菌株的吸附作用可能是多重重金屬吸附機理的復合效應，具體作用機理還有待進一步分析。

通過對ln（（qe－qt）/qe）和時間t作圖（圖3-b）發現，120 min內，該菌株吸附過程較符合Lagergren一級動力學方程，R2為0.975，當吸附時間超過120 min后，方程的回歸系數逐漸降低。一級動力學方程是基于反應物濃度與反應速度之間調控關系的方程，即溶液中重金屬的濃度對吸附速度會有一定的影響[19]，一級動力學方程只能較好地模擬該菌株吸附反應的初始階段，說明溶液中重金屬的濃度對菌株吸附初期的反應速度起決定性影響，但吸附后期反應物濃度不是控制吸附作用的決定性因素，因此，該菌株對鉛的吸附過程不是單一的作用機理，與二級動力學模型分析得出的結論一致。

其次，菌株吸附數據與顆粒內擴散方程和Elovich方程擬合系數R2分別為0.611和0.859，其擬合相關性不如二級動力學方程，說明Pb2+在顆粒內部的擴散對反應速度的影響不大，但吸附過程部分受擴散因子的調控，結果表明，菌株活細胞吸附機理存在多重復合作用。動力學研究表明[35]，當吸附反應速率很快時，總吸附速率由膜擴散、內擴散或二者共同控制，菌株GDYX03活細胞顆粒內擴散不明顯，因此，吸附速率以膜擴散作用為主，推測在整個吸附過程中，表面吸附起到了主導作用，但還有少量的胞內積累。綜合分析，二級動力學方程能較好地描述菌株活細胞吸附Pb2+的整個過程，可為生物吸附反應器的設計提供理論依據。

2.4 等溫吸附方程

等溫吸附模型用來描述吸附劑與吸附液中重金屬離子之間的平衡關系，Langmuir等溫吸附模型較常用，Freundlich等溫吸附模型為經驗公式，二者均需在相應的理想條件下進行模型擬合[36-37]。

式中，qm為最大吸附量，qe為單分子層吸附達到平衡時的吸附量，Ce為平衡吸附的重金屬濃度，k1為與吸附自由能相關的Langmuir吸附平衡常數。

RL為平衡參數，可用于反映吸附劑和吸附物之間的關系，RL在0～1間表示吸附劑吸附，RL＝0吸附反應不可逆，RL＝1為線性，RL＞1不利于吸附反應進行[38]。其方程如下。

其中，C0為溶液的不同初始濃度。

其中，k2為與吸附能力有關的Freundlich吸附平衡常數，1/n為與吸附強度相關的經驗常數，受材料不均勻度影響。n值的大小可說明吸附作用的線性程度，當n＝1時，吸附為線性，當n＜1時，為化學吸附，當n＞1時，為物理吸附[39]。

將菌體對Pb2+吸附的數據按吸附等溫方程進行擬合、回歸分析，相關參數如表3，4所示，其擬合效果較好，運用SPSS軟件得到Langmuir擬合方程和Freundlich擬合方程。

表3 等溫吸附方程回歸Langmuir擬合計算得到的相關參數

表4 等溫吸附方程回歸Freundlich擬合計算得到的相關參數

結果顯示，菌株對Pb2+吸附的Langmuir等溫吸附模型R2為0.996，Freundlich等溫吸附模型R2為0.831，表明該菌株的吸附過程更適合用Langmuir等溫吸附模型來描述。在最佳吸附條件下，隨著Pb2+初始質量濃度的增加，平衡參數RL減少，且RL在0～1之間，表明菌株活細胞對Pb2+的吸附是有利的，該吸附劑可以較好地用于Pb2+的吸附。

2.5 透射電鏡分析

通過透射電鏡對菌體活細胞內部形態進行觀察，由圖4-a可知，菌株GDYX03呈短桿狀，倆端鈍圓，在沒有和鉛離子接觸時，菌體周圍呈電子透明層；在鉛離子初始質量濃度為100 mg/L條件下（圖4-b），細胞表面和內部都不規則地堆積著大量具有衍射現象的電子不透明小顆粒，表明菌株GDYX03吸附鉛離子過程不但有快速的表面吸附，還發生了緩慢的胞內積累，但胞內積累作用不大，分析其原因：一是在吸附過程中，由于沒有營養物質的提供，菌體無法進行正常的生理代謝，從而影響細胞的主動運輸，鉛離子無法進入細胞內部；二是在鉛離子質量濃度為100 mg/L條件下，菌體通過減少胞內積累量來保護自身，避免毒害作用；而當菌體在Pb2+質量濃度1 000 mg/L條件下（圖4-c），細胞表面的顆粒量比鉛離子質量濃度為100 mg/L時的數量少，但細胞內部顆粒數量增多，說明當Pb2+質量濃度大到一定程度時，離子間的斥力增強，吸附位點處于飽和狀態，細胞表面還可能發生脫吸附現象，因此，表面吸附作用降低，而細胞內外濃度差增大，促進胞內積累，但整體吸附作用效果下降。因此，可初步認為，在無營養物質提供的條件下，菌株GDYX03適用于低濃度Pb2+污染的修復，其吸附作用以菌體細胞表面吸附為主要作用機制，或將Pb2+還原為Pb原子，又或與胞外某些陰離子發生絡合反應形成沉淀聚集在細胞表面，而胞內積累作用不大，金羽等[40]在研究耐鉛細菌的吸附特性中也證實了該結果。

2.6 紅外光譜分析

按照文獻[40]對比分析吸附重金屬前后菌體的紅外光譜（圖5），結果表明，IR譜圖出現明顯差異，集中表現在微生物分析靈敏區500～1 800，2 800～3 500 cm-1[41]，吸附重金屬后部分基團的吸收峰都發生變化，菌株在低質量濃度Pb2+100 mg/L的溶液中作用時，與不含Pb2+相比，其IR譜圖基本類似，部分峰位發生微移，胺基-NH2的最大吸收位置從3 276.52 cm-1遷移到 3 283.26 cm-1，烷基 CH2反對稱伸縮吸收峰從2994.48cm-1遷移到3000.26cm-1，糖類CH3，CH2，CH伸縮對稱最大吸收位置從2916.37cm-1遷移到2923.60cm-1；菌株在高質量濃度Pb2+500mg/L條件時，更多基團的峰位發生偏移，烷基CH2反對稱伸縮吸收峰從2994.48cm-1遷移到3006cm-1，糖類CH3，CH2，CH伸縮對稱最大吸收位置從2916.37cm-1遷移到2 930.35 cm-1，羰基C=O伸縮振動吸收峰從1 635.37 cm-1遷移到1 641.63 cm-1，帶N-H彎曲振動與C-N伸縮振動的疊加位置從1 578.96 cm-1遷移到1 586.67 cm-1，醇類C-OH伸縮振動的最大吸收峰從1 027.41 cm-1遷移到1 025.48 cm-1，膦酸OP-O對稱伸縮位置從887.59cm-1遷移到894.34cm-1。結果表明，官能團 -NH2，CH2，C＝O，C-OH，O-P-O是主要的吸附位點，-NH2在低濃度時，可提供孤對電子與Pb2+配位結合，正如PETHKAR等[42-44]的研究；酰胺I，II帶譜峰也發生了偏移，說明蛋白質中的酰胺基也可能起作用，或是糖類、脂類物質，黃飛等[20]也證實了該結論。但是通過圖5發現，吸附后IR譜圖的吸收峰強度或峰形基本沒有變化，而且沒有新的譜帶出現，表明菌株吸附過程中，細胞成分的活性基團與Pb2+發生絡合作用，但不是主要的作用機制。

3 結論

本研究結果表明，高耐鉛土著菌GDYX03的活細胞對鉛離子的吸附過程中，無營養物質提供的菌體活細胞吸附比生長過程菌株的吸附效果好，且無營養物質提供的活細胞吸附以胞外吸附為主。

取5 g/L（干菌量）培養72 h的活細胞于pH值5～6、初始Pb2+質量濃度100 mg/L的溶液中，30℃振蕩作用30 min，此時吸附效果最好，吸附率為98.852%，吸附量為19.73 mg/g。分析其原因可知，該菌株吸附效果主要受菌體表面活性位點的影響，吸附過程中發生了離子交換、表面微沉淀、靜電吸附、表面絡合等。

菌株GDYX03的整個吸附過程能很好地符合Pseudo二級動力學模型，表明其吸附作用是多種重金屬吸附機理的復合效應，可能是物理吸附，也可能是化學吸附，還可能是生物代謝型吸附，結合其他動力學模型分析，該吸附過程以膜擴散為主，即主要是胞外吸附，還有少量的胞內積累。Langmuir等溫吸附模型也能很好地描述菌株GDYX03對鉛離子的吸附過程，平衡參數RL在0～1之間，表明菌株活細胞對Pb2+的吸附是有利的，可較好地用于對Pb2+的吸附。

通過透射電鏡分析菌株GDYX03吸附重金屬前后細胞內部的變化情況，結果表明，菌株對Pb2+的吸附主要是細胞表面的吸附，具有衍射現象的電子不透明小顆?；蚴荘b2+還原為Pb原子，或是與胞外某陰離子絡合反應形成沉淀。而紅外光譜分析可得出，細胞成分中 -NH2，CH2，C=O，C-OH，O-P-O及酰胺基等是吸附作用中發生絡合反應的主要活性基團，但該作用不是主要機制。

綜上可知，菌株GDYX03活細胞吸附過程主要是靠細胞的胞外作用，以化學、物理吸附為主要作用機理，如靜電吸附、離子交換、表面絡合、表面微沉淀等多重復合吸附機理共同影響菌株的吸附效果，還有部分胞內積累作用，且證明菌株GDYX03可用于低質量濃度Pb2+污染土壤的生物修復。