白僵菌對(duì)栗實(shí)象甲幼蟲血細(xì)胞數(shù)量的影響

趙俊芳，樊金華，冀衛(wèi)榮

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，山西 太谷 030801）

栗實(shí)象甲（Curculio davidi Fairmaire）又名栗實(shí)象鼻蟲、栗蛆，屬鞘翅目象甲科，為世界性板栗害蟲，該害蟲分布廣泛，是各個(gè)板栗產(chǎn)地的主要害蟲之一[1]。2015年我國板栗總面積達(dá)到180萬hm2，年產(chǎn)量195萬t，占世界板栗總產(chǎn)量的84%[2]。栗實(shí)象甲幼蟲危害果實(shí)，成蟲以取食栗樹的幼葉和嫩芽為主，晚上蟄伏在葉子重疊處。該害蟲繁殖能力極強(qiáng)，當(dāng)晚進(jìn)行交配第2天便可產(chǎn)卵，并且該成蟲反應(yīng)靈敏，遇到危險(xiǎn)時(shí)能迅速飛逃，導(dǎo)致防治效果一直不太顯著[3]。隨著社會(huì)進(jìn)步和科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們對(duì)該害蟲的防治方法越來越多，但近年來板栗害蟲防治效果仍不太明顯，每年仍有20%～45%的板栗果實(shí)受損害，嚴(yán)重地區(qū)可達(dá)70%以上，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[4-6]。

蟲生真菌在我國害蟲防治方面應(yīng)用很廣泛。在我國北方，人們利用白僵菌成功防治了一種極難控制的森林害蟲——馬尾松毛蟲，在我國南方，使用白僵菌對(duì)水稻害蟲有著極好的防治效果。南非等國使用金龜子綠僵菌防治飛蝗害蟲，而巴西等國利用金龜子綠僵菌防治甘蔗沫蟬等害蟲。近些年，由于生物技術(shù)變得更加成熟，越來越多的蟲生真菌產(chǎn)品進(jìn)入市場，產(chǎn)生了巨大的經(jīng)濟(jì)效益，市場前景廣闊[7-8]。

本研究采用球孢白僵菌對(duì)栗實(shí)象甲幼蟲進(jìn)行侵染，通過觀察蟲體的病變特征及血細(xì)胞數(shù)量的變化，了解球孢白僵菌對(duì)栗實(shí)象甲幼蟲的致病性及致病力，為球孢白僵菌投入實(shí)踐防治栗實(shí)象甲提供有力依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株 本試驗(yàn)使用從中國科學(xué)院購買的SYN01球孢白僵菌作為供試菌[9]。

1.1.2 供試蟲源 2016年10月下旬由山西省晉中市昔陽縣農(nóng)家購買板栗，帶回學(xué)校，在地上平鋪塑料膜并蓋上一層新鮮濕潤的土壤，這時(shí)把板栗均勻平鋪在土壤上，等待幼蟲出土，每天保持土壤濕潤給幼蟲出土提供合適的條件。3 d左右就有幼蟲出土，每天從土里捉蟲并把幼蟲保存到合適的生存環(huán)境中，這種出土狀態(tài)大約保持14 d。取出來的栗實(shí)象甲幼蟲即為試驗(yàn)對(duì)象。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 供試菌株及孢子懸浮液的制備 供試菌株球孢白僵菌SYN01，用PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯2 g、葡萄糖 0.2 g、瓊脂 0.15～0.2 g、蒸餾水 10 mL，自然pH）培養(yǎng)，直到白僵菌完全產(chǎn)孢，在無菌環(huán)境下的操作臺(tái)里，用接菌環(huán)將5板球孢白僵菌SYN01刮入50 mL的三角瓶內(nèi)，分別加入等量的20 mL含0.05%吐溫－80的蒸餾水，搖勻，制得濃度為3.2×108孢子/mL的白僵菌孢子懸液，然后取出少量，稀釋后得到1.6×107，8×106孢子/mL這2個(gè)濃度。

1.2.2 同種白僵菌的3個(gè)濃度對(duì)栗實(shí)象甲幼蟲的高致病力篩選 選擇狀態(tài)相同的栗實(shí)象甲幼蟲200只，將其隨機(jī)分為4組，3個(gè)試驗(yàn)組1個(gè)對(duì)照組（以吐溫-80溶液為對(duì)照），用滅菌后的移液槍吸取10 μL準(zhǔn)備好的球孢白僵菌孢子懸浮液，均勻滴涂于一只蟲體的體表。將感染不同濃度球孢白僵菌孢子懸浮液的蟲子分別放入滅過菌的有土燒杯中。將放有處理過蟲子的燒杯均置于恒溫培養(yǎng)箱（RH＞95%）中，等待血細(xì)胞的采集。

1.2.3 血淋巴的采集 用滅過菌的鑷子從燒杯中取4只蟲子，用75%的酒精對(duì)蟲體進(jìn)行表面消毒，然后用無菌水沖洗干凈，用吸水紙吸干蟲體表面水分。

將蟲體固定，在靠近蟲體頭部的背面，用昆蟲針沿背面表皮穿刺，血淋巴會(huì)從傷口溢出，呈小水珠狀，用2.5 μL的移液槍吸取血淋巴。

1.2.4 血細(xì)胞的觀察和鑒定 將收集的淋巴液集于EP管中，管中有提前放入的預(yù)冷抗凝血?jiǎng)┮苑乐购诨Ｓ靡埔簶屧贓P管中抽推幾次，以達(dá)到混勻的效果，然后用2.5μL的移液槍在EP管中吸取2μL的收集液，滴于用酒精擦拭過的血球計(jì)數(shù)板上，置于顯微鏡下觀察血細(xì)胞的個(gè)數(shù)，并記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 侵染后蟲體及血細(xì)胞的變化

栗實(shí)象甲幼蟲被真菌侵染后，48 h后蟲體由原來的淺黃色變?yōu)榘咨w壁與對(duì)照相比質(zhì)軟，穿刺更容易；72 h時(shí)部分蟲體出現(xiàn)針孔大小的黑死斑點(diǎn)，一只有5～8個(gè)斑點(diǎn)，此時(shí)活性明顯降低，同時(shí)取出的血淋巴呈渾濁且無形狀，內(nèi)臟更易從傷口隨淋巴液流出，但對(duì)照為偏黃色透明水珠。

2.2 白僵菌對(duì)蟲體血細(xì)胞數(shù)量的影響

為了了解菌液對(duì)血細(xì)胞數(shù)量的影響，以侵染栗實(shí)象甲幼蟲的時(shí)間點(diǎn)為零點(diǎn)，以此類推，分別在侵染后的3，6，12，24，48，72，96 h 對(duì)血細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在濃度為3.2×108孢子/mL的球孢白僵菌孢子懸液侵染下，栗實(shí)象甲幼蟲在3～6 h血細(xì)胞數(shù)量呈上升狀態(tài)，6～72 h時(shí)血細(xì)胞數(shù)量急劇下降并在72 h達(dá)到最低值。在1.6×107孢子/mL的白僵菌孢子懸液侵染下，3～6 h血細(xì)胞數(shù)量緩慢上升，在6～12 h血細(xì)胞數(shù)量恢復(fù)到與3 h時(shí)基本相同，12～48 h血細(xì)胞數(shù)量以上升狀態(tài)增長，48～96 h血細(xì)胞數(shù)量呈下降狀態(tài)并且在72 h數(shù)量也達(dá)到一個(gè)最低值。在8×106孢子/mL的白僵菌孢子懸液侵染下，栗實(shí)象甲幼蟲血細(xì)胞數(shù)量在3～96 h過程中血細(xì)胞數(shù)量一直是下降狀態(tài)，并在72 h達(dá)到最低值，之后變化較為平緩。CK組的栗實(shí)象甲幼蟲血細(xì)胞數(shù)量在3～12 h時(shí)呈上升狀態(tài)，12～96 h時(shí)呈急劇下降狀態(tài)，48 h后較為平穩(wěn)（圖1）。總體上與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組的栗實(shí)象甲幼蟲血細(xì)胞的數(shù)量呈現(xiàn)出先升高后降低的動(dòng)態(tài)變化。

3 結(jié)論與討論

栗實(shí)象甲是采用兩性生殖（Sexual reproduction）繁殖后代的，6—7月份成蟲羽化，在土中潛伏10～15 d，等到栗蓬長到核桃大小時(shí)鉆出土面，出土?xí)r期多集中于每年的7—8月[10]，白天在栗樹上取食栗樹的幼葉和嫩芽，取食一段時(shí)間，等到營養(yǎng)充足之時(shí)開始交配產(chǎn)卵且周期極短，次日便可產(chǎn)下，多數(shù)產(chǎn)卵于幼果果蒂附近的產(chǎn)卵孔，一般每孔產(chǎn)1～3顆卵。遇到危險(xiǎn)時(shí)反應(yīng)靈敏迅速飛逃，同時(shí)該害蟲還具有假死性，一般在夜里活動(dòng)很少或者不活動(dòng)，蟄伏于栗葉重疊處，趨光性不強(qiáng)[11-12]。昆蟲的血細(xì)胞種類繁多，傳統(tǒng)上根據(jù)血細(xì)胞的大小、組成以及功能來分類。近年來，開始應(yīng)用基因標(biāo)記等技術(shù)進(jìn)行分類[13]。其血細(xì)胞中的漿細(xì)胞和粒血胞占很大比例，所以，這2種細(xì)胞同時(shí)也是栗實(shí)象甲免疫反應(yīng)的2種重要細(xì)胞。正常生活的栗實(shí)象甲幼蟲在3～6 h內(nèi)體內(nèi)血細(xì)胞數(shù)量呈上升狀態(tài)且變化幅度不大。感染了白僵菌孢子原液的栗實(shí)象甲幼蟲，起初由于體內(nèi)免疫反應(yīng)導(dǎo)致了血細(xì)胞數(shù)量的急劇增加，然后隨著時(shí)間推移，在6～72 h血細(xì)胞數(shù)量急劇下降，經(jīng)過72 h血細(xì)胞數(shù)量趨近于0，這時(shí)的昆蟲致死率極高，72 h后尚存活的栗實(shí)象甲幼蟲由于免疫系統(tǒng)較為強(qiáng)大，血細(xì)胞數(shù)量呈上升狀態(tài)。感染了濃度為1.6×107孢子/mL的白僵菌孢子懸液的栗實(shí)象甲幼蟲，起初由于體內(nèi)免疫反應(yīng)比正常生活的幼蟲血細(xì)胞數(shù)量較多一些，直到72 h，血細(xì)胞數(shù)量與正常生活的幼蟲較為相近，但是比正常生活的高一些，72～96 h體內(nèi)血細(xì)胞數(shù)量緩步上升，96 h以后由于體內(nèi)適應(yīng)了白僵菌的感染，血細(xì)胞數(shù)量呈穩(wěn)定上升狀態(tài)。感染了濃度為8×106孢子/mL的白僵菌孢子懸液的栗實(shí)象甲幼蟲，其血細(xì)胞數(shù)量走勢也和前幾種類似，在72 h之內(nèi)血細(xì)胞數(shù)量呈下降狀態(tài)，由于白僵菌孢子懸液稀釋成8×106孢子/mL，幾乎對(duì)蟲體無影響，因此，72 h以后體內(nèi)血細(xì)胞數(shù)量呈急劇上升狀態(tài)，96 h以后血細(xì)胞數(shù)量緩慢減小。蟲生真菌的優(yōu)勢在于，它可以直接進(jìn)入昆蟲的體腔，并在其體內(nèi)發(fā)揮作用。因此，蟲生真菌能侵染其他病原物不能侵染的害蟲發(fā)育的各個(gè)時(shí)期。正因?yàn)檫@樣，蟲生真菌比大多數(shù)生物殺蟲劑的效果都要好很多。

雖然蟲生真菌的優(yōu)勢這么明顯，但也不是所有的效果都很好，因?yàn)檎婢枰l(fā)揮作用不僅只靠自身，而且也看環(huán)境和寄主是不是合適[14-15]。對(duì)于昆蟲本身而言，真菌作為一種外來入侵物，一般都會(huì)使昆蟲自身產(chǎn)生免疫反應(yīng)，但效果不一定明顯，也就是說昆蟲體內(nèi)的免疫系統(tǒng)不一定能把蟲生真菌消滅。因此，一旦環(huán)境適合蟲生真菌入侵到昆蟲體內(nèi)，昆蟲自身的免疫反應(yīng)很難發(fā)揮作用，但昆蟲有時(shí)候能夠通過自身的血細(xì)胞發(fā)揮作用，阻止孢子的萌發(fā)，降低感病概率[16]。