豬圓環(huán)病毒2型快速直接PCR檢測(cè)方法的建立與流行病學(xué)調(diào)查

徐引弟 ，閆靜娟 ，焦文強(qiáng) ，王治方 ，張青嫻 ，朱文豪 ，李海利 ，王克領(lǐng)

（1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，河南 鄭州 450002；2.河南省畜禽繁育與營(yíng)養(yǎng)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002）

豬圓環(huán)病毒（Porcine circovirus，PCV）屬于圓環(huán)病毒科（Circoviridae）圓環(huán)病毒屬，是無(wú)囊膜包裹的單股負(fù)鏈環(huán)狀DNA病毒。PCV根據(jù)血清型可以分為PCV1，PCV2和PCV3。其中，PCV1在豬群中廣泛存在，但無(wú)致病性[1-3]。PCV2主要引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（Post weaning multi systemic wasting syndrome，PMWS），該病多發(fā)生于5～12周齡的保育豬，臨床主要表現(xiàn)為精神沉郁、被毛粗亂、呼吸困難、腹瀉以及進(jìn)行性消瘦。此外，PCV2還易和呼吸與繁殖障礙綜合征病毒（PRRS）、細(xì)小病毒（PPV）、偽狂犬病毒（PRV）等發(fā)生混合感染，造成并發(fā)或繼發(fā)感染[4-7]。自1991年P(guān)MWS首次報(bào)道以來(lái)，歐洲、亞洲以及大洋洲等先后報(bào)道此病，呈全球性分布[8-10]。2001年，郎洪武等[11]首次成功分類(lèi)PCV2，證明我國(guó)存在PCV2感染情況。華中農(nóng)業(yè)大學(xué)何啟蓋教授課題組是我國(guó)第一個(gè)報(bào)道我國(guó)存在致病性的新型豬圓環(huán)病毒PCV3，研究發(fā)現(xiàn)，PCV3與豬只繁殖障礙等疾病相關(guān)聯(lián)，之后山東農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所鄭書(shū)軒等也報(bào)道了PCV3的存在[12-13]。

PCV2基因組為小型的單鏈環(huán)狀DNA，大小約為1.7 kb，可能包含11個(gè)開(kāi)放閱讀框（open reading frames），其中有3個(gè)主要開(kāi)放閱讀框。ORF1為最大開(kāi)放閱讀框，與病毒滾環(huán)復(fù)制有關(guān)。ORF2編碼Cap結(jié)構(gòu)蛋白，構(gòu)成病毒核衣殼，具有較大變異性。ORF3可能與誘導(dǎo)病毒凋亡以及編碼病毒致病性相關(guān)蛋白有關(guān)[7]。

對(duì)于PCV2的診斷方法有很多，比如病毒分離法、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法、免疫熒光法、熒光定量等[13-14]，但是與這些方法相比，本試驗(yàn)建立的直接PCR檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單方便，快速、特異，敏感，更適合對(duì)于PCV2引起疾病的及時(shí)、準(zhǔn)確診治和防控，有利于流行病學(xué)調(diào)查。

本試驗(yàn)建立的直接PCV2的PCR檢測(cè)方法用于河南省PCV2的檢測(cè)，研究PCV2的流行情況，并對(duì)陽(yáng)性樣品進(jìn)行了ORF2基因序列分析，旨在為PCV2的防控提供參考。

1 材料和方法

1.1 病料采集

樣品來(lái)自2016年5月至2017年5月河南及周邊地區(qū)疑似PCV2感染送檢的豬組織病料，包括脾臟、肺臟、腎臟、淋巴結(jié)等組織。病豬肺臟顏色為灰色、質(zhì)地似橡皮，腎臟有不同程度的出血點(diǎn)，淋巴結(jié)腫大等特征。分別取病變明顯和正常組織交界部分的病料用于試驗(yàn)研究。

1.2 試劑

2×Direct PCR Mix，Hot Start Taq 酶，Ezup 柱式動(dòng)物基因組DNA抽提試劑盒，購(gòu)自生工生物工程（上海）有限公司；DL2000 DNA Marker，瓊脂糖均購(gòu)自寶生物（大連）生物有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 引物設(shè)計(jì)

參考GenBank中收錄的PCV2 ORF2的核苷酸序列，應(yīng)用OLigo6.0軟件設(shè)計(jì)1對(duì)引物，P1，P2用于樣品的檢測(cè)，目的片段長(zhǎng)494 bp。P1:5′-CCGCA CCTTCGGATATACTATC-3′，P2：5′-CACGGATATT GTATTCCTGGT-3′，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，于-20℃保存。

1.4 樣品處理

采集有PCV2型典型癥狀的豬只的肺臟、腎臟、脾臟、淋巴結(jié)等病變組織的病料少許研磨，加入2 mL的滅菌PBS緩沖液，低速離心數(shù)秒后取上清液直接用于PCR模板。

1.5 直接PCR檢測(cè)方法的建立

1.5.1 直接PCR反應(yīng) 反應(yīng)體系為20 μL，含有處理后的樣品上清 1 μL，2×Direct PCR Mix 10 μL，10 pmol/L P1 1 μL，10 pmol/L P2 1 μL，5 U/μL Hot Strart Taq 酶 0.5 μL，加滅菌 ddH2O至 20 μL。充分混勻，陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照分別取1 μL加入19 μL PCR擴(kuò)增試劑。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?8℃30 s；然后35個(gè)循環(huán)：98℃5 s，55℃5 s，72℃5 s；最后 72℃1 min。取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物電泳觀察結(jié)果。

1.5.2 直接PCR特異性試驗(yàn) 將已經(jīng)鑒定的豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬藍(lán)耳病病毒（PRRSV）、豬瘟病毒（CSFV）和豬偽狂犬病病毒（PRV）陽(yáng)性病料為模板，用1.3所設(shè)計(jì)的PCV2的特異性引物P1，P2按照已經(jīng)建立的方法進(jìn)行擴(kuò)增，電泳，并觀察結(jié)果。

1.5.3 直接PCR敏感性試驗(yàn) 采集的樣品處理后取1 μL上清作為模板，依次10倍稀釋至10-5，各取1 μL作為直接PCR擴(kuò)增，確定其敏感性。

1.6 臨床樣品的調(diào)查

對(duì)2016年5月至2017年5月送檢的河南及周邊地區(qū)疑似PCV2感染的125份樣品的組織病料采用建立的直接PCR檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，陽(yáng)性結(jié)果進(jìn)行測(cè)序分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 直接PCR方法的建立

樣品經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單處理，加入直接PCR體系擴(kuò)增，結(jié)果顯示，該P(yáng)CR體系可以擴(kuò)增出一條約為494 bp的PCV2的基因片段（圖1），且符合預(yù)期片段大小。

2.2 特異性試驗(yàn)

在反應(yīng)程序、其他反應(yīng)體系不變，只有模板不同的情況下用建立的PCR方法對(duì)PCV2擴(kuò)增出了494 bp的目的基因片段，而PEDV，PRRSV，CSFV和PRV均未擴(kuò)增出特異性條帶（圖2）。證明該方法有較好的特異性。

2.3 敏感性試驗(yàn)

將模板按10倍濃度梯度稀釋分別擴(kuò)增，結(jié)果顯示，模板稀釋度為100（原液），10-1，10-2，10-3時(shí)，均能擴(kuò)增出特異性條帶，對(duì)10-4，10-5均無(wú)擴(kuò)增（圖3），說(shuō)明該體系對(duì)PCV2的擴(kuò)增下限濃度為10-3，證明該方法敏感性好。

2.4 臨床樣品的調(diào)查

應(yīng)用建立的PCV2 PCR檢測(cè)方法檢測(cè)2016年5月至2017年5月送檢的河南省疑似PCV2感染的125份樣品。結(jié)果顯示，陽(yáng)性樣品有55份（圖4），陽(yáng)性率高達(dá)44%。序列分析結(jié)果顯示，這55株陽(yáng)性PCV2毒株之間的ORF2區(qū)域核苷酸同源性為88.7%～99.8%，42份在PCV2b基因群。結(jié)果表明，河南省PCV2感染率較高，PCV2b為流行血清亞型，病毒變異嚴(yán)重。

3 討論

PCR方法敏感性和特異性較好，是臨床病原學(xué)診斷中較為普遍的一種方法。但是傳統(tǒng)的PCR方法從樣品的裂解、DNA提取、PCR擴(kuò)增到電泳檢測(cè)需要5 h以上。本試驗(yàn)建立的PCV2快速直接PCR方法，樣品簡(jiǎn)單處理，直接擴(kuò)增，快速反應(yīng)，整個(gè)過(guò)程1 h內(nèi)完成。敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示，建立PCR檢測(cè)方法的靈敏度可達(dá)病料模板10-3稀釋度。特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示，本試驗(yàn)建立的PCV2 PCR檢測(cè)方法能擴(kuò)增出494 bp目的片段，對(duì)PEDV，PRRSV，CSFV和PRV均未擴(kuò)增出目的片段，說(shuō)明該方法有很好的特異性。因此，建立的直接PCR檢測(cè)方法為PCV2的檢測(cè)及流行病學(xué)調(diào)查提供了簡(jiǎn)單、有效的方法。

通過(guò)建立的PCR檢測(cè)方法，對(duì)2016年5月—2017年5月共收集到的125份疑似PCV2感染樣品進(jìn)行檢測(cè)，共檢測(cè)到55份陽(yáng)性樣品，陽(yáng)性率高達(dá)44%，這表明在河南省PCV2感染率較高。

對(duì)PCV2陽(yáng)性病料ORF2基因進(jìn)行序列分析，同源性在88.7%～99.8%，主要在PCV2b基因群。PCV2b為流行血清亞型，與前人研究結(jié)果一致[15-20]，為PCV2的防控和新型疫苗研制奠定基礎(chǔ)。