河南省規模化豬場支氣管敗血波氏桿菌的流行病學研究

張青嫻 ，徐引弟 ，王治方 ，朱文豪 ，焦文強 ，李海利 ，方劍玉 ，郎利敏 ，張立憲 ，游 一 ，許 峰 ，鄭萬錄 ，王克領

（1.河南省農業科學院畜牧獸醫研究所，河南 鄭州 450002；2.河南省畜禽繁育與營養調控重點實驗室，河南 鄭州 450002）

支氣管敗血波氏桿菌（Bordetella bronchiseptica，Bb）是引起多種哺乳動物呼吸道隱性感染及急、慢性呼吸道炎癥的病原菌，為嚴格寄生菌，豬、羊、馬、牛、鼠、兔、狗、貓等多種動物都可感染該病，還可感染雪貂、刺猬、狐等野生動物，甚至可以感染人。Bb可引發豬萎縮性鼻炎（Atrophic rhinitis，AR），是豬呼吸道疾病綜合征（porcine respiratory disease complex，PRDC）的重要病原菌之一[1]。Bb 的先期感染可使機體免疫力下降，更容易繼發感染其他多種病原，從而增加豬群呼吸道疾病的發病率和嚴重程度，造成嚴重經濟損失[2-3]。

為了解河南省豬Bb的流行病學情況，采集近年來河南省發生呼吸道疾病的規模化豬場病料組織，對Bb進行分離鑒定，分析其流行概況，為客觀評估河南省豬Bb的危害提供依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 病料來源 對2015—2017年河南省各地市的規模化豬場發生明顯萎縮性鼻炎癥狀的豬采集鼻拭子樣品，有肺炎癥狀的豬無菌采集肺組織，部分瀕臨死亡的病豬采集氣管、心血和關節液等組織，共采集到1 022份樣品。對于采集到的樣品，立即進行Bb的分離鑒定。

1.1.2 試劑、培養基 胰蛋白胨大豆瓊脂培養基（tryptic soy agar，TSA）、胰蛋白胨大豆肉湯培養基（tryptic soy broth，TSB）購自Difco公司。麥康凱（MC）瓊脂、鮑-姜氏培養基、普通營養瓊脂、NAD（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸）革蘭氏染色液、生化管、新鮮羊血等試劑購自上海生工生物工程有限公司。藥敏紙片購自杭州濱和微生物試劑有限公司。Taq PCR master mix，DL2000 DNA Marker等 PCR 試劑購自寶生物（大連）有限公司。

1.2 Bb的染色鏡檢

將經無菌采集的病料劃線接種于TSA平皿，置于37℃培養24～48 h后，挑取半透明、光滑且直徑1～2 mm的菌落進行革蘭氏染色。染色結果顯示，Bb為紅色的陰性小桿菌或球桿菌，呈現較典型的兩極濃染，挑取可疑菌落傳代純化后進行生化及PCR鑒定。

1.3 生化鑒定

按使用說明進行以下生化試驗：氧化/發酵（O/F）管、乳糖、葡萄糖、MR、吲哚、VP、西蒙氏枸櫞酸鈉、硝酸鹽還原、硫化氫、觸酶、尿素和氧化酶，并接種于綿羊血鮑-姜氏培養基和麥康凱培養基。

1.4 Bb的PCR鑒定

參考GenBank上的flaA基因序列（序列號AF232939）設計 1 對引物：F1：5′-TGGCGCCTGCCC TATC-3′，F2：5′-AGGCTCCCAAGAGAGAAA-3′，擴增目的片段大小為237 bp，由寶生物大連分公司合成。

取40 μL無菌水置于1.5 mL離心管中，挑取單菌落懸浮混勻后，100℃水浴5～10 min，迅速冰浴5 min，置于高速離心機中4℃10 000 r/min離心2 min，取上清作為PCR模板。

配制 25 μL PCR 反應體系：10×Taq Mix Buffer 13 μL，10 μmol/L 上、下游引物各 1.0 μL，無菌水19μL，模板1μL。PCR反應程序為：94℃變性5min；94℃ 30 s，54℃30 s，72℃ 40 s，進行 30個循環；最后72℃延伸10 min；PCR產物于4℃保存。取5 μL PCR產物，經1%瓊脂糖凝膠100 V電壓下電泳45 min后，用凝膠成像系統觀察結果。

1.5 Bb的共感染菌情況調查

將發病豬病料無菌接種于含胎牛血清和NAD的TSA培養基中，分離出可疑菌落，純化傳代后進行PCR鑒定。根據相關文獻，設計4對引物（表1），對鏈球菌（Streptococcus，S.suis）、副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis，HPS）、大腸桿菌（Escherichia coli，E.coli）和巴氏桿菌（Pasteurella multicida，Pm）的菌株，分別進行PCR擴增，確定菌株種類。

表1 Bb的共感染細菌所用引物

2 結果與分析

2.1 Bb的生長培養特性和生化試驗

Bb在含血清的TSA平皿上生長成黃白色、圓形、光滑、直徑約1 mm的小菌落（圖1）。分離菌株在10%綿羊血鮑-姜氏培養基上生長呈珍珠狀，周邊有邊界不清楚的明顯β-溶血環，這說明分離菌株都是Bb I相菌（圖2）。在1 000倍顯微鏡下，Bb顯示為革蘭氏陰性小桿菌或球桿菌，菌體形態一致，有兩極著色趨向（圖3）。

Bb的生化特征為糖發酵管上有菌膜形成，不發酵任何糖類，西蒙氏枸櫞酸鈉試驗、硝酸鹽還原試驗陽性，觸酶和氧化酶陽性，尿素陽性，不產生靛基質，MR和VP陰性。

2.2 Bb的PCR鑒定結果

由圖4可知，分離菌株經支氣管敗血波氏桿菌flaA基因PCR鑒定后，在237 bp處呈現陽性條帶者定為Bb檢測陽性。

2.3 Bb的細菌共感染結果

圖5為鑒定4種常見共感染細菌的PCR結果，結果表明，陽性結果與預期設想一致。1 022份組織病料中，一共分離出波氏桿菌82株，總分離率只有8.0%，其中，有30份組織病料只分離出波氏桿菌，52 份共感染病料以 S.suis，HPS，E.coli，Pm居多，且鼻拭子分離率低于肺臟組織。

3 討論與結論

本試驗從河南省各地市規模化豬場采集呼吸道病豬的鼻拭子和肺臟、關節等組織樣品，樣品數量和來源在一定程度上代表了河南省Bb的組織分離特點和實際感染情況。但由于呼吸道與外界接觸廣泛，容易滋生大量雜菌，且Bb生長慢于許多存在于上呼吸道中的其他細菌，再加上臨床大量用藥，導致Bb分離率較低[8-10]。Bb是呼吸道的常在菌，本試驗分離時不僅能從肺臟、氣管、鼻拭子等呼吸系統組織中分離到，還可以從部分病豬的關節、心血分離到該菌，說明Bb可以從呼吸系統進入血液循環，造成全身感染。

一般情況下，Bb毒力較弱，人工感染試驗證實，毒力很強的Bb也不能引起明顯的或進行性鼻甲萎縮或鼻盤變形[11-14]。目前研究認為，單一的Bb感染并不能導致豬群嚴重發病，而如果豬群中已感染 Bb，可促進其他多種病原（如 E.coli，HPS，S.suis，豬繁殖與呼吸障礙綜合征、豬流感病毒等）的繼發感染，造成的損失嚴重[15-18]。

本研究中Bb與豬鏈球菌、副豬嗜血桿菌和豬大腸桿菌共感染的比例較高，是否在一定程度上促進S.suis，HPS和E.coli在河南省的流行，有待進一步的研究[19-20]。因本試驗在細菌分離的同時，未進行病毒學相關檢測，故不排除存在PRRSV，SIV等病毒共同感染的可能。