IL-35在特應性皮炎樣小鼠模型中的表達

王 倩 劉 偉 薛 競 王 勤 張麗霞

特應性皮炎(atopic dermatitis, AD)是一種常見的慢性、復發性、炎癥性皮膚病，主要表現為濕疹樣皮炎、頑固性瘙癢及皮膚干燥、皮膚屏障損害，病程中常伴有哮喘和/或過敏性鼻炎。在過去的二三十年間，全球AD的患病率大幅度增加，有學者回顧了1990-2010年間的69項研究，顯示在部分發達國家兒童AD患病率已高于20%，并且在非洲、東亞等發展中國家患病率也在增高[1]。AD確切發病機制未明，但免疫失衡已被認為在其發病中起重要作用。近年研究發現，除Th2細胞占優勢外，Th17/Treg細胞之間平衡狀態的打破也可能是關鍵因素。IL-35作為一種由Treg細胞分泌的新抑制性細胞因子在炎性疾病中的作用開始受到重視，但IL-35與AD發病的關系目前尚未見報道。本研究旨在利用特應性皮炎樣小鼠模型初步探討IL-35在特應性皮炎發病中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑 4～6周齡SPF級BALB/c雌性小鼠30只(成都達碩生物科技有限公司)；2, 4-二硝基氟苯(DNFB，美國Sigma公司)；小鼠IL-35、IL-4、IFN-γ、IL-17 ELISA試劑盒(上海鑫樂生物科技有限公司)；TRIZOL(美國Invitrogen公司)；PrimeScript RT reagent Kit[寶生物工程(大連)有限公司]；SYBR Premix Ex Taq II Kit[寶生物工程(大連)有限公司]；引物由上海生工生物工程技術服務有限公司設計合成，序列為：IL-12p35上游引物5’-CATCTGGCGTCTACACTGCTGCTGAA-3’，下游引物5’-ACTGAGGTGGTTTAGGAGGGCAAGGG-3’；EBI3上游引物5’-TCCAAGGAACAGAGCCACAGAGCAT-3’，下游引物5’-TGAAGGACGTGGATCTGGTGGAGTTG-3’；酶標儀(型號Multiskan Mk3，美國ThermoFisher儀器有限公司)；實時熒光定量(RT-PCR)儀(型號PikoReal，美國ThermoFisher儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 特應性皮炎動物模型的建立 參照本研究小組既往實驗建立模型[2]：小鼠先在恒溫恒濕清潔級環境中飼養2周，適應環境之后進入實驗。實驗前用8%硫化鈉淀粉溶液脫去小鼠背部面積約2 cm×4 cm毛發。將30只小鼠隨機分為模型組及對照組，每組15只。模型組用丙酮：橄欖油3∶1溶液作為基質配置0.5% 2,4-二硝基氟苯(DNFB)，0.5%DNFB 100 μL外涂背部進行2次誘導(實驗第1天和第2天各涂搽一次)，實驗第2周(第7天)起每隔2天背部涂搽1次，每次70 μL，第28天涂搽后造模完成。對照組小鼠背部脫毛區給予等量基質(丙酮∶橄欖油3∶1)，時間及涂搽劑量與實驗組一致。

1.2.2 血清IL-35、IL-4、IFN-γ、IL-17水平的檢測 造模成功后，兩組小鼠經腹腔注射10%水合氯醛1 mL/kg麻醉后摘除右側眼球取血，將收集的血液于37℃靜置30 min后以3500 r/min離心15 min，分離收集上層血清，-80℃保存。血清中IL-35、IL-4、IFN-γ、IL-17濃度采用生物素雙抗體夾心酶聯免疫吸附法(ELISA)，嚴格按照試劑盒說明書進行操作，于450 nm處測量吸光度值，使用相關軟件繪制標準曲線并計算血清樣本中IL-35、IL-4、IFN-γ、IL-17的含量。

1.2.3 組織學形態觀察 無菌條件下取兩組小鼠背部皮膚組織，約1 cm×0.5 cm，以10%甲醛固定，常規石蠟包埋、切片，觀察兩組小鼠背部皮膚組織學改變。

1.2.4 RT-PCR檢測皮膚組織中IL-12p35 mRNA及EBI3 mRNA水平 無菌條件下取兩組小鼠背部皮膚組織，約0.5 cm×0.5 cm，迅速冷凍在液氮中，再放入-80℃保存。之后在液氮條件下研磨組織至粉末狀，將粉末倒入去RNA酶的EP管中，加入1 mL TRIZOL，再用TRIZOL法提取小鼠皮膚總RNA。按照試劑盒說明書進行逆轉錄及RT-PCR擴增。反應體系如下：SYBR Premix Ex Taq II 10.0 μL，上、下游引物各0.4 μL，cDNA模板2.0 μL，ddH2O 6.4 μL。反應條件：以95℃ 30 s預變性，95℃ 5 s變性，55℃ 30 s退火，72℃ 30 s充分延伸，共40個循環。每個樣本設三個復孔，取其平均Ct值，以β-actin為內參，通過2-△△Ct計算IL-12p35、EBI3的mRNA相對表達量。

2 結果

2.1 模型組小鼠背部皮損表現及組織病理學改變 對照組小鼠背部皮膚正常(圖1a)，模型組小鼠背部可見紅斑、丘疹、滲出、漿痂、增厚、苔蘚樣變等改變(圖1b)。對照組小鼠背部皮膚組織鏡下結構基本正常(圖2a),模型組小鼠背部皮膚組織鏡下可見角化過度伴角化不全、棘層增厚、海綿水腫、真皮淺層淋巴細胞為主的炎細胞浸潤等特應性皮炎樣改變(圖2b)。

2.2 模型組小鼠及對照組小鼠血清中IL-35、IL-4、IFN-γ、IL-17的表達 模型組小鼠血清中IL-35濃度明顯低于對照組[(326.39±27.19)pg/mL vs. (362.78±59.64)pg/mL]，差異有統計學意義(P<0.05)；模型組小鼠血清中IL-4、IL-17濃度均明顯高于對照組[(33.98±3.92)pg/mL vs. (29.93±4.41)pg/mL，(257.50±26.14)pg/mL vs. (179.61±36.43)pg/mL]，差異有統計學意義(P<0.05)；模型組小鼠血清中IFN-γ濃度較對照組有所降低，但差異無統計學意義[(371.22±39.18)pg/mL vs. (398.98±48.69)pg/mL，P>0.05]。見表1。

2.3 模型組小鼠血清中IL-35濃度與IL-4、IFN-γ、IL-17濃度的相關性 將模型組小鼠血清中IL-35濃度與IL-4、IFN-γ、IL-17濃度進行相關性分析，結果顯示IL-35與IL-17呈負相關(r=-0.611，P=0.015)；而與IL-4、IFN-γ無明顯相關性(r=-0.117, 0.435，P=0.679,0.106)。

2.4 模型組小鼠及對照組小鼠背部皮膚組織中IL-35亞單位(IL-12p35及EBI3)mRNA的表達 IL-12p35mRNA在模型組小鼠背部皮損中的相對表達量(0.57±0.37)明顯低于對照組(1)，差異有統計學意義(t=-2.461，P=0.021)；EBI3 mRNA在模型組小鼠背部皮損中的相對表達量(0.65±0.55)也較對照組(1)降低，差異有統計學意義(t=-2.074，P=0.047)；且模型組小鼠背部皮損中IL-12p35 mRNA與EBI3 mRNA表達呈顯著正相關(t=0.962，P=0.000)。見圖3。

表1 模型組及對照組血清中IL-35、IL-4、IFN-γ、IL-17表達水平的比較

圖1 對照組(1a)及模型組(1b)小鼠背部皮膚表現 圖2 對照組(2a)及模型組(2b)小鼠背部皮膚組織病理表現(HE，×200)

圖3 對照組及模型組小鼠背部皮膚IL-12p35(3a)及EBI3 mRNA(3b)相對表達量，*P<0.05

3 討論

特應性皮炎(AD)是一種慢性、反復性、炎癥性皮膚病，瘙癢劇烈，常伴有哮喘和/或過敏性鼻炎，嚴重影響患者生活質量。AD發病機制復雜，涉及遺傳、免疫、環境、感染、生理病理等多種因素。目前已有大量研究證實Th1/Th2細胞網絡失衡是AD的發病基礎[3,4]。此外，促進炎癥反應的Th17細胞和抑制炎癥反應的Treg細胞之間的細胞平衡是機體維持免疫穩態的重要因素，其平衡的打破也可能在AD的發病中占有重要地位[5]。

IL-35是近年新發現的一種抑制性細胞因子，于1990年被發現，2007年由Collison等[6]命名。IL-35為IL-12家族的新成員，是由IL-12p35(IL-12A)亞基與EB病毒誘導基因3(EpsteinBarr virus-induced gene 3，EBI3)蛋白組成的異源二聚體，主要由Treg細胞分泌。IL-35是Treg細胞發揮免疫抑制效應必需的，其性質穩定，在體內外能抑制傳統T細胞的增殖并誘導幼稚T細胞轉換成iTreg，具有強大的免疫抑制作用[7,8]。近年研究發現IL-35在血液系統疾病[9]、心血管疾病[10]、慢性肝炎病毒感染[11]、自身免疫性疾病[12,13]、腫瘤[14]等多種疾病中參與炎癥的免疫調節。除此之外，IL-35也被發現在過敏性疾病如過敏性哮喘及過敏性鼻炎的發病中起重要作用，有學者[15]研究表明Treg細胞主要是通過IL-35抑制Th17細胞的分化和IL-17因子釋放的方式發揮作用。Li等建立了Balb/c小鼠過敏性氣道疾病模型，發現將腺病毒介導的IL-35基因轉入小鼠體內能明顯減低氣道高反應性、增加肺組織中CD4+CD25+Fox3+T細胞的數量并降低支氣管肺泡灌洗液中IL-4、IL-5、IL-13及IL-17的水平[16]。此后，在一些過敏性鼻炎或哮喘的動物模型及患者體內進行的試驗進一步證實了IL-35對Treg細胞的上調作用和對Th2、Th17細胞的抑制作用[17,18]。鑒于AD這一皮膚科常見的過敏性炎性疾病與過敏性氣道疾病的發病機制有相似之處，故我們推測IL-35亦可能在AD發病中起負調控作用。我們采用了DNFB誘導的特應性皮炎樣小鼠模型對IL-35在AD發病中的作用做了初步探討，目前鮮有報道。

本次實驗研究發現，在特應性皮炎樣小鼠模型血清中IL-4、IL-17水平明顯高于對照組，IFN-γ水平較對照組有所降低，這與特應性皮炎急性期Th2細胞占優勢及Th17促進其發病的理論相符[19,20]；而其血清中IL-35水平較對照組明顯下降提示Treg免疫抑制功能的減弱。此外，模型組小鼠血清中IL-35與IL-17呈負相關，這在一定程度上代表了Th17/Treg比例的失衡，與過敏性氣道疾病的研究結果類似，進一步證實了Th17/Treg細胞失衡是導致過敏性炎性疾病的重要原因之一。另外，我們的研究還發現特應性皮炎樣小鼠模型皮損中IL-12p35 mRNA與EBI3 mRNA表達均較對照組明顯降低，提示IL-35可能在抑制皮損形成方面發揮作用。Wang等[21]的研究顯示IL-35可能會抑制活化的CD4+CD25-T細胞產生IL-4并逆轉Th1/Th2的失衡，而我們此次研究并未發現模型組小鼠血清中IL-35水平與IL-4、IFN-γ水平有相關性。但由于此次研究樣本量較小，結果的局限性及偏倚性不可避免，故尚待更大樣本及更深入的人體試驗進一步進行相關驗證。

綜上，該研究提示，IL-35可能參與特應性皮炎的發病，尤其在維持Th17/Treg平衡方面可能發揮作用，但其靶蛋白的表達、其對Th1/Th2的影響及發揮作用的具體機制等方面還有待進一步研究。