外用苯烯莫德對特應性皮炎樣小鼠的治療作用

蘭宇貞 慕彰磊 趙 琰 孫 婧 張建中

苯烯莫德是一種小分子化合物，化學名為5-(2-苯乙烯基)-2-異丙基-1，3-苯二酚，是一種新型非激素類免疫調節劑[1]。國外一項臨床研究顯示，外用苯烯莫德乳膏對特應性皮炎具有治療作用[2]，但其作用機制目前仍不清楚, 也無與糖皮質激素及鈣調神經磷酸酶抑制劑的對比研究。卡泊三醇(MC903)外用于BALB/c小鼠可誘導出紅斑、干燥、鱗屑、水腫、滲出、皮膚肥厚等特應性皮炎(AD)樣皮膚癥狀，可見表皮增生，嗜酸細胞、肥大細胞、T淋巴細胞等炎癥細胞浸潤，促進角質形成細胞合成胸腺基質淋巴細胞生成素(TSLP)，較好的復制了AD的重要特征[3,4]。MC903誘導的AD樣小鼠模型，已經得到國際公認。本研究利用MC903誘導的AD樣BALB/c小鼠模型，觀察外用苯烯莫德乳膏對AD的治療作用，并與糖皮質激素及鈣調神經磷酸酶抑制劑相比較，本研究還觀察了苯烯莫德治療對AD樣小鼠皮膚屏障功能及部分免疫反應的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 6周齡雌性BALB/c小鼠，購自北京維通利華公司(北京)。MC903購于Sigma公司。0.5%、1.0%苯烯莫德乳膏及乳膏基質均由天濟藥業(深圳)有限公司提供。兔抗人TSLP抗體、兔抗人CD4抗體均購自Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及藥物處理 36只小鼠隨機分為6組，每組6只，即：正常對照組、基質組、0.5%苯烯莫德組、1.0%苯烯莫德組、0.1%糠酸莫米松組和0.1%他克莫司組。正常對照組不予任何處理；分別將1 nmol(10 μL)MC903溶液均勻涂于其余小鼠的每側耳背皮膚，連續9天，于第10天對所有小鼠的耳部皮損進行評分，并根據分組情況給藥治療12天。正常對照組不予任何藥物；其余小鼠每日上午8時涂抹1 nmol(10 μL)MC903溶液維持模AD模型，上午10時按分組涂抹50 μL相應藥物于雙側耳背。

1.2.2 皮損評分 分別于治療前和治療12天后，對小鼠耳部皮損評分。評分根據癥狀分為紅斑/充血、鱗屑/干燥、水腫三項，每項根據癥狀的輕重程度評為0～3分：0(無癥狀)、1(輕度)、2(中度)、3(重度)。以三項評分相加所得總分評估皮損的嚴重程度。

1.2.3 耳部皮膚厚度測量和經皮水丟失(TEWL)檢測 分別于治療前后，用游標卡尺測量小鼠耳部厚度，并進行記錄。治療12天后，使用經皮水丟失記錄儀TewameterTM300對各組小鼠的耳背皮膚進行經皮水丟失(TEWL)測定。

1.2.4 HE染色及免疫組化 剪下小鼠耳部組織，將其中一側置于4%多聚甲醛固定24 h，酒精梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋后，制備切片(4 μm)。HE染色，觀察各組小鼠皮損組織病理變化；分別使用兔抗人TSLP抗體、兔抗人CD4抗體進行免疫組化染色，并于每張切片取3個高倍視野(×400)計數表達TSLP表皮細胞、CD4+T細胞數量。

1.2.5 統計學方法 所有數據均以均數±標準差表示，應用SPSS 24.0統計軟件分析，每組前后比較采用配對樣本t檢驗，各組比較采用One-way ANOVA分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 苯烯莫德治療對AD樣BALB/c小鼠耳部皮損評分的影響 AD樣小鼠雙側耳背表現出明顯紅斑、充血、干燥、水腫、鱗屑，耳部皮膚明顯增厚。治療12天后，0.5%苯烯莫德、1.0%苯烯莫德、0.1%糠酸莫米松及0.1%他克莫司組小鼠耳部紅斑、鱗屑、水腫及毛細血管擴張程度均明顯減輕(圖1)。治療前后，AD樣小鼠皮損評分見表1。治療前基質組、0.5%苯烯莫德組、1.0%苯烯莫德組、糠酸莫米松組、他克莫司組均高于正常對照組，AD樣小鼠各組之間無明顯差異。治療12天后，0.5%苯烯莫德乳膏組較治療前降低60.36%(t=25.298,P<0.001)；1.0%苯烯莫德乳膏組降低63.76%(t=9.286,P<0.001)，兩組評分均明顯低于同期基質組(F=62.127,P<0.001)，與糠酸莫米松組差異無顯著性，1.0%苯烯莫德組顯著低于他克莫司組(P<0.05)，0.5%苯烯莫德組與他克莫司組及1.0%苯烯莫德組比較，差異無顯著性。見表1。

a:正常對照組; b:基質組；c:0.5%苯烯莫德組；d:1.0%苯烯莫德組；e:0.1%糠酸莫米松組；f:0.1%他克莫司組

表1 治療前后各組小鼠皮損評分

注：n=6，與正常對照組比較a：P<0.01；與基質組比較b：P<0.01

2.2 苯烯莫德治療前后耳部皮膚厚度變化 治療前AD樣小鼠耳部皮膚厚度高于正常對照組(F=89.113,P<0.01)。治療12天后， 1.0%苯烯莫德組、0.5%苯烯莫德組小鼠耳部皮膚厚度均較治療前減小(t值分別為14.050和15.704，均P<0.001)。治療組均小于基質組，(F=111.725，均P<0.001)。其中，0.1%糠酸莫米松組明顯小于其他三組，P<0.05；1.0%苯烯莫德組、0.5%苯烯莫德組與他克莫司組無顯著性差異；1.0%苯烯莫德組小于0.5%苯烯莫德組，P<0.05。見表2。

2.3 苯烯莫德治療后AD樣BALB/c小鼠皮膚組織結構的變化 AD樣小鼠組織病理可見表皮顯著增生，棘層肥厚，角化過度及不全，表皮內可見細胞間水腫，真皮淺中層毛細血管擴張，血管周圍可見較致密的單一核細胞浸潤，并可見嗜酸性粒細胞浸潤。與基質組相比，治療組小鼠的表皮增生、單一核細胞浸潤及嗜酸粒細胞浸潤程度明顯減輕(圖2)。

2.4 苯烯莫德治療對AD樣BALB/c小鼠TEWL的影響 基質組小鼠TEWL顯著高于正常對照組(F=19.319，P<0.001)；0.5%苯烯莫德組、1.0%苯烯莫德組、0.1%糠酸莫米松組、0.1%他克莫司組均顯著低于基質組(P<0.01)；0.5%苯烯莫德組和1.0%苯烯莫德組均低于糠酸莫米松組(P<0.05)，與他克莫司組比較無顯著差異；0.5%苯烯莫德組與1.0%苯烯莫德組比較差異不顯著(圖3)。

表2 治療前后各組小鼠耳部皮膚厚度

注：n=6，與正常對照組比較a：P<0.01；與基質組比較b：P<0.01

a：正常對照組; b：基質組；c：0.5%苯烯莫德組；d：1.0%苯烯莫德組；e：0.1%糠酸莫米松組；f：0.1%他克莫司組

圖3 治療后各組小鼠經皮水丟失程度(與基質組比較：**P<0.01)

2.5 苯烯莫德治療對AD樣BALB/c小鼠皮損內CD4+T細胞的影響 治療后，基質組皮損內CD4+T細胞浸潤程度顯著高于正常對照組。糠酸莫米松組、1.0%苯烯莫德組、0.5%苯烯莫德組和他克莫司組均較基質組減輕(F=44.794，P<0.01)。0.5%和1.0%苯烯莫德組與0.1%糠酸莫米松組及0.1%他克莫司組比較均無顯著性差異，0.5%和1.0%苯烯莫德組之間比較差異亦不顯著(圖4、5)。

2.6 苯烯莫德治療對AD樣BALB/c小鼠皮損內TSLP表達的影響 免疫組化結果顯示，與正常對照組相比，基質組小鼠TSLP蛋白表達水平明顯升高，1.0%苯烯莫德組、糠酸莫米松組、他克莫司組和0.5%苯烯莫德組，均較基質組下調(F=70.833，P<0.01)。其中，1.0%苯烯莫德組和0.1%糠酸莫米松組顯著低于0.5%苯烯莫德組(P<0.05)，其余各治療組之間無顯著性差異(圖6、7)。

a：正常對照組;b：基質組；c：0.5%苯烯莫德組；d：1.0%苯烯莫德組；e：0.1%糠酸莫米松組；f：0.1%他克莫司組

圖5 CD4+T細胞計數(與基質組比較：**P<0.01)

3 討論

特應性皮炎(atopic dermatits，AD)是一種慢性炎癥性皮膚病，以劇烈瘙癢和復發性濕疹樣皮損為特征[5]。近年來，AD的發病率在世界范圍內逐年上升，部分國家兒童患病率超過20%，成人患病率為10%～20%[6]。AD的一線治療包括潤膚劑和外用藥物，目前AD的外用藥物以糖皮質激素和鈣調神經磷酸酶抑制劑為主，二者長期用藥均存在安全性隱患。

苯烯莫德是國家1.1類新藥，是一種新型非激素類免疫調節劑[7]。臨床研究顯示，外用苯烯莫德可以顯著而快速的減輕斑塊狀銀屑病的皮損，療效優于糖皮質激素及卡泊三醇[8]。苯烯莫德能促進來源于白癜風患者正常皮膚的黑素細胞系PIG3V細胞的增殖、遷移，使酪氨酸酶活性及黑素含量增加，可能直接促進白癜風患者黑素細胞發揮合成黑素的功能[9]。國外一項臨床研究顯示，與安慰劑組相比，外用苯烯莫德乳膏對輕到重度特應性皮炎患者的濕疹面積及嚴重程度評分(EASI)、臨床SCORAD評分(包括瘙癢嚴重程度)均有明顯改善，且安全性較好[2]

a：正常對照組; b：基質組；c：0.5%苯烯莫德組；d：1.0%苯烯莫德組；e：0.1%糠酸莫米松組；f：0.1%他克莫司組

圖7 表達TSLP的表皮細胞計數(與基質組比較：**P<0.01)

本研究結果顯示，苯烯莫德可明顯減輕AD樣小鼠的紅斑、鱗屑及水腫癥狀，及耳部皮膚厚度。治療12天后AD樣小鼠耳部皮損評分較治療前顯著降低。治療后，小鼠耳部皮膚厚度明顯減小，其中1.0%苯烯莫德較0.5%苯烯莫德效果更好。提示苯烯莫德對AD具有較好的治療作用，且治療效果與苯烯莫德濃度相關。

AD的發病機制非常復雜，環境因素、遺傳因素、皮膚屏障功能受損及免疫系統異常均參與發病，并可相互作用。其中皮膚屏障功能及免疫異常是兩大主要因素，也是目前受關注最多的因素。

AD患者常出現特征性的皮膚干燥，以及TEWL增加，這意味著他們皮膚屏障功能受損[10]。本研究發現1.0%與0.5%苯烯莫德乳膏均可降低AD樣小鼠的TEWL程度，效果優于0.1%糠酸莫米松，提示苯烯莫德乳膏有修復皮膚屏障的修復作用。AD樣小鼠耳部CD4+T細胞浸潤明顯，表皮細胞TSLP表達增加，這與AD的病理生理特征一致。本研究發現，苯烯莫德乳膏治療后，AD樣小鼠局部CD4+T細胞浸潤顯著減輕，TSLP表達下調，與0.1%糠酸莫米松及他克莫司組無顯著差異。TSLP可激活樹突狀細胞，刺激原始CD4+T細胞產生Th2細胞因子IL-4、IL-5、IL-13及TNF-α，活化神經元細胞和免疫細胞導致瘙癢產生，誘導樹突狀細胞和角質形成細胞表達胸腺和活化調劑趨化素(TARC/CCL17)和巨噬細胞趨化因子(MDC/CCL12)，而CCL17可以通過與Th2細胞表達的CC趨化受體4(CCR4)相結合從而趨化Th2細胞[11，12]。有研究顯示AD嚴重程度與血清TSLP及CCL17水平相關[13]。本研究結果提示苯烯莫德可減輕MC903誘導的AD樣小鼠的局部炎細胞浸潤，可能通過下調TSLP，抑制Th2細胞因子表達來實現。