斑塊型汗孔角化癥一家系MVK基因突變檢測

葉珊珊 李瑩潔 王東霞 李 卉 王再興

汗孔角化癥(porokeratosis，PK)是一種常染色體顯性遺傳的慢性角化不全性皮膚病，具有遺傳異質性[1]。1875年Isidor Neuman首次發現此病特點，但于1893年被Vittorio Mibelli命名為“汗孔角化癥”[2]。繼斑塊型汗孔角化癥(porokeratosis of Mibelli，PM)被發現后，PK的其它幾種常見臨床亞型及少見特殊類型陸續被認識，而播散性淺表性光化性汗孔角化癥(DSAP)是最為常見的一種亞型。PK臨床表現可見中央萎縮，邊緣呈堤狀隆起的環狀斑塊，病理檢查以角化不全柱為其特征性表現[3]。其中，斑塊型汗孔角化癥(PM)常表現為單個或數個孤立性環狀的角化不全性皮損，少數可出現直徑達20 cm的斑塊[4]。PM常于兒童期發病，病變于四肢多見，但身體其他部位也可能受影響，如手掌、足底、口唇黏膜及生殖器部位[5]。臨床上極少出現不同類型的汗孔角化癥同時出現在同一個體，但既往有報道表明PM可與淺表播散型、線狀型、疣狀斑塊型及播散性淺表性光化性汗孔角化癥共存[6]。同時，PM具有一定的惡變風險。由于PK的發病呈家族聚集性，進一步證明遺傳因素在疾病發生具有重要作用。目前研究發現甲羥戊酸途徑相關酶突變與PK的發生密切相關，主要包括MVK、PMVK、MVD、FDPS[7]。其中MVK基因位于12q24.11，含有11個外顯子，約23 576 bp，仍是目前研究的熱點基因。早期研究認為，MVK基因的突變為DSAP主要的致病基因，后經學者們進一步驗證發現，MVK與PM的發病同樣具有密切相關性。在本研究中，我們通過對1個斑塊型汗孔角化癥家系7例患者進行了MVK基因的突變檢測，并進一步明確MVK基因突變與PM發病的相關性。

1 資料與方法

1.1 研究對象 本研究對象為1個PM家系，其中包括先證者和6例家系患者，7例患者均具有典型PM臨床表現，其中先證者由安徽醫科大學第一附屬醫院皮膚科專家確診，并行組織病理檢查進一步明確。先證者臨床表現為：雙下肢及軀干部對稱分布的呈黃豆至蠶豆大暗棕色環狀斑塊，邊緣呈堤狀隆起，中央見萎縮狀(圖1a)。皮膚組織病理可見典型的角化不全柱(圖1b)。該家系為3代，發病年齡在5～38歲不等(圖2)，家系其他6例患者皮損均較輕，病變部位于右下肢伸側單發多見(圖1c)，均為斑塊狀，偶伴有瘙癢不適癥狀。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣本收集 在獲得該家系成員知情同意的情況下，我們抽取了7例發病患者和家系內2名未發病健康對照的外周靜脈血液樣本各5 mL于EDTA抗凝管內，并置于-80℃冰箱中保存。

1.2.2 外周血DNA提取 將冷凍樣本于常溫中解凍化開。使用人外周血全血基因DNA提取試劑盒(QIAGEN，德國)，按照標準操作程序，提取該家系血液樣本中的DNA。并將提取到的DNA進行純度檢測標化。

1.2.3 PCR引物設計 通過美國國家生物信息中心數據庫(NCBI)檢索出MVK基因外顯子序列，并應用在線Primer3.0 軟件對MVK基因所有外顯子進行引物設計。所有引物由上海天昊生物科技有限公司合成。

1.2.4 PCR引物擴增、純化 PCR反應在2720型PCR擴增儀(美國ABI公司)上完成。總反應體積為20 μL。擴增循環參數：95℃預變性15 min；94℃變性15 s，62℃退火40 s，每循環減0.5℃，72℃延伸1 min，共11個循環；94℃變性15 s，57℃退火30 s，72℃延伸1 min，共24個循環；最后72℃延伸2 min，4℃保存。8 μL PCR產物與0.5 U 蝦堿性磷酸酶和4 U核酸外切酶混合，放入水浴鍋中，37℃孵育1 h，隨后75℃ 15 min將蝦堿性磷酸酶和核酸外切酶滅活，取得純化PCR產物。

1.2.5 DNA序列分析 純化后的PCR產物采用3730XL遺傳分析儀直接測序，并將測序結果在Polyphred 軟件上進行分析，同時將檢測出的結果與既往測得的676名健康對照的全部外顯子進行比較[8]。

2 結果

通過對比MVK基因編碼區的全部外顯子及其側翼序列，在7例發病患者的6號外顯子上均發現c.604G>A(p.Gly202Arg)錯義突變，即第604位的鳥嘌呤(G)突變為腺嘌呤(A)，導致蛋白質序列的第202位甘氨酸突變為精氨酸(圖3)。同時將該突變與676名健康對照的全部外顯子進行對比后，未發現此突變。應用SIFT和Polyphen工具對該突變進行分析，得出分值分別為0和1，推算出該突變為有害突變[1]。

圖1 1a為先證者，下肢可見密集分布的暗棕色環狀斑塊，邊緣隆起，少許鱗屑；1b為先證者組織病理，鏡下可見角化不全柱，顆粒層消失，真皮血管擴張，周圍炎細胞浸潤(HE，×40)；1c為家系中發病患者，右下肢見兩個孤立性環狀斑塊

圖2 汗孔角化癥患者家系圖 圖3 家系突變檢測圖

3 討論

汗孔角化癥(PK)是一種少見的慢性進行性角化不全的皮膚疾病，為常染色體顯性遺傳性疾病，具有遺傳異質性。臨床上可見一個或多個邊緣堤狀隆起，中央萎縮的環狀斑塊，局部出現或散發于全身。角化不全柱為組織病理的特征表現。雖然目前對PK發生的病因尚不清楚，但認為長期紫外線照射、器官移植、臟器功能衰竭及免疫受抑等原因導致角質形成細胞異?？寺∮嘘P[9,10]。結合本家系先證者臨床表型及組織病理，可明確診斷為PM，于1893年首先被Vittorio Mibelli認識并命名的一種常見類型的汗孔角化癥。在本家系中，發病患者可見與先證者類似皮損，但多為單個或數個孤立性斑塊，于四肢多見，幼年至青年時發病，同樣符合PM診斷特點。

PM進展緩慢，但可出現數量增多，皮損加重等情況，如本家系中的先證者，也可進一步出現惡變可能。早在1942年首先由Vigne報道出，7%的斑塊型汗孔角化癥患者可能出現惡變趨勢。這種致癌潛能可能是由于角樣板層附近的角質形成細胞中p53過度表達導致的結果[11]。因而早期積極干預，定期隨訪是本病治療的一個關鍵措施。

近年國內學者研究發現，甲羥戊酸途徑上相關酶基因突變，與汗孔角化癥的發生密切相關，其中主要包括MVK、PMVK、MVD、FDPS。早在2012年，國內學者Zhang采用全基因組外顯子測序，發現了MVK為播散性淺表性光化性汗孔角化癥(DSAP)的致病基因，但并未發現MVK與PM的發病具有關聯性[12]。隨后在2014年，Zeng通過全基因組測序的方法，在1個PM家系中，發現了MVK上的突變位點c.1039+1G>A，進一步證實MVK參與了PM的發病[5]。2015年，Zhang等通過平行測序和外顯子拷貝數變異分析，發現PK患者中存在甲羥戊酸途徑相關酶的基因突變，其中23例PM患者為MVK突變，這進一步明確，MVK與PM的發病密切相關[1]。在本次研究中，我們結合家系臨床表型并將該家系DNA進行Sanger測序篩查后發現，在MVK基因上第6號外顯子，編碼序列為c.604 G>A的錯義突變，是既往于播散性淺表性光化性汗孔角化癥(DSAP)患者中發現過的突變位點[1,12]，更加證實MVK是PM的致病基因。

根據近年國內學者歸納的關于DSAP突變基因發現，MVK的突變率為60.3%，其突變熱點為c.395delT和c.604G>A，突變比率均為5.7%[13]。后一突變熱點與本家系突變一致，但不同的是，在本家系中該突變導致的臨床表型為斑塊型汗孔角化癥。結合本家系研究，猜測MVK上的c.604G>A突變在斑塊型汗孔角化癥及播散性淺表性光化性汗孔角化癥均能發生致病作用。

MVK基因編碼的甲羥戊酸激酶是甲羥戊酸途徑上的關鍵酶，此通路對細胞的生長、分化具有重要作用，而MVK基因突變可能導致酶結構功能及活性的改變，從而促進了PK的發生。MVK基因上目前已發現40余種突變位點[14]。通過既往研究總結發現，MVK基因突變可見于多個臨床表型[15]，其中常見的有斑塊型PK、播散性淺表性PK、播散性淺表性光化性PK[14]和線狀PK。且在不同個體中，即使攜帶同一突變位點也可能出現不同的臨床表型，這可能與患者所處的生活狀態及環境因素密切相關。本文通過對1個PM家系進行MVK基因的突變研究，檢測出了一個既往于DSAP患者中發現過的突變位點c.604 G>A，進一步證明了MVK與PM的發病密切相關，更值得關注的是c.604 G>A為PM與DSAP共同的突變位點，這更加讓我們深刻地認識到外界因素對遺傳疾病的臨床表型具有重要作用。