結核病3種實驗診斷方法比較與分枝桿菌耐藥情況分析

曹廷智 梁芳 唐怡敏 葉濤聲 張國良

（1深圳市第三人民醫院 廣東 深圳 518112）

（2北京中醫藥大學深圳醫院 廣東 深圳 518172）

結核病是當下對人類健康產生巨大危害的一種傳染性疾病，發病率有逐年上升趨勢，我國結核病發病率在位居世界第二。當下，國內對結核病的診斷方法以涂片鏡檢法、羅氏固體培養法、液體培養法、PCR 基因檢測法等為主，其中涂片鏡檢和分枝桿菌培養為結核病臨床診斷與鑒別的“金標準”[1]。提升結核病分枝桿菌的檢測速度與陽性檢出率，對本病癥早期診斷、合理用藥有很大意義。本文對2014年—2017年結核病實驗檢測結果與分枝桿菌耐藥情況進行分析。

1.資料與方法

1.1 一般資料

取2013年—2017年在我院肺病診療中心疑似結核病320例患者的960份痰標本（每位患者均連續送檢3次），其中男202例，女118例。

1.2 儀器與試劑

BACTEC MGIT 960全自動分枝桿菌快速培養儀，以及與其相配套試劑（MGIT培養管、生長添加劑、雜菌抑制劑以及PZA藥敏試劑盒等）；標本前處理液：4% N-乙酰-L 半胱氨酸-氫氧化鈉，pH6.7磷酸鹽緩沖液。

1.3 方法

1.3.1 樣本前處理流程：依照BACTEC MGIT 960 全自動分枝桿菌檢測系統操作指南進行，量取0.5ml沉渣置入MGIT培養管中，并提取0.5ml沉渣與中性羅氏培養基接種，進行涂片處理，等到涂片自然干燥后采用抗酸染色辦法，統計其最初涂片陽性率。

1.3.2 藥敏試驗：應用比例法，結合BACTEC MGIT 960操作指南落實藥敏操作步驟。BACTEC MGIT 960可以對鏈霉素（SM）、異煙肼（INH）、利福平（RFP）、乙胺丁醇（EMB）與吡嗪酰胺（PZA）五類一線抗結核藥物的敏感性進行檢測，藥物最終濃度分別為1.0、0.1、1.0、5.0與100μg/L，敏質量控制菌株設為H37RV。

1.3.3 陽性檢出情況的處理辦法：BACTEC MGIT 960儀器報告結果提示陽性后，拿取陽性培養管，制作兩張涂片，進行抗酸染色和革蘭染色各1份。如果抗酸染色陽性，判定為分枝桿菌生長；如果抗酸染色陰性，要另行普通細菌培養與革蘭染色，以明確是否存在他類細菌或真菌，若有即判斷標本被污染。羅氏培養基放置在37℃溫箱內，每周觀察2次，如果發覺有可疑菌落存在，處理辦法與判斷依據與上述相同。

1.3.4 菌型鑒定：若涂片檢查結果提示分枝桿菌生長麥序提取100μl培養物，加進膠體金檢測條內，數分鐘后觀察結果，陽性代表是結核分枝桿菌。

1.3.5 耐藥結果判斷：藥敏SM、INH、RFP與EMB 使用1個生長對照管，采用1∶100將對照管稀釋處理。PZA藥敏應用專用培養液，1∶10稀釋對照管。若生長對照管的生長單位（GU）≥400，需評估裝有藥物的培養管，若其GU≥100，則判斷為耐藥，否則為敏感。

2.結果

2.1 結核菌3種實驗診斷的基本情況

3種方法中，涂片鏡檢時間最短（2.1h），羅氏固體培養陽性檢測時間最長（21.5d），MG960液體培養檢出率最高（9.4%），詳見表1。

表1 結核菌3種實驗診斷的基本情況比較

2.2 39株結核菌藥敏檢出情況

27株對5種抗結核一線藥物均敏感，但未出現EMB的菌株，詳見表2。

表2 39株結核菌藥敏檢出情況

3.討論

結核病是一類由分枝桿菌感染誘發的慢性傳染性疾病，呼吸道傳播是本病癥主要傳播途徑，提升分枝桿菌的檢測速度與檢出陽性率，第一時間獲得其藥敏結果，在防治結核病方面上體現出一定價值[2]。涂片鏡檢、分枝桿菌培養和PCR檢測，為臨床上常采用的診斷方法。涂片鏡檢具有迅速、操作簡單、經濟性等優勢，但敏感性較低，且只有在痰樣本含菌量達到104/ml時才可以檢出，本次研究僅為1.9%，與其他兩種診斷方法陽性檢出率相比較，存在顯著差異（P＜0.05）。分枝桿菌培養由于該菌落生長速度遲緩，平均約為18h分裂1次，故此檢測時間相對較長，本次研究為21.5d，且分枝桿菌的培養基需存有改良的羅氏固體培養基和液體培養基，其內含有對普通細菌生長過程抑制的成分，分枝桿菌在培養基表面長出菌落，經由涂片染色鏡檢后，可提示出陽性，相關報道顯示，其陽性報告時間平均是21.7d[3]。PCR檢測技術有快速、靈敏度高、特異性強等優勢，若能夠聯合DNA測序，還可能實現對種型鑒定[4]。

在本次研究中，采用膠體金法與AccuProbe探針方法，對39株核分枝桿菌進行了藥敏試驗。結果顯示：27株對5種抗結核一線藥物均敏感（69.2%），耐藥的有12株（30.8%），略低于國家調查公布的46%的全國平均耐藥水平。本次研究也對MDR-TB進行計算，其比例為2.6%，相對較低，這可能和受檢群體是疑似結核者相關，入組患者多數是首次發現，幾乎沒有接受過系統治療[5]。

綜上所述，MGIT 960液體培養為較有效的結核分枝桿菌的實驗室檢測方法，具有檢測時間短、陽性率較高等優勢。結核分枝桿菌對PZA的耐藥性最高，INH次之。