高效液相色譜法測定葡萄酒中白藜蘆醇含量的研究

（1.懷化市產商品質量監督檢驗所，湖南 懷化 418000；2.沅陵縣食品藥品工商質量監督管理局，湖南 沅陵 419600）

我國造酒歷史悠久，葡萄酒作為深受人民群眾喜愛的酒精飲料之一，其釀造多是通過將新鮮葡萄（或葡萄汁）經發酵制成。研究指出，適度飲酒對機體具有一定的保健效果，這是因為葡萄酒中富含白藜蘆醇、黃酮類、多酚類等物質，其中白藜蘆醇具有保護心血管、抑制腫瘤、抗氧化、消除自由基、預防糖尿病、預防心肌病等功效[1]。但目前不同葡萄酒品種中白藜蘆醇含量的測定方法仍無完全統一，高效液相色譜法（HPLC）是色譜法的一個重要分支，以液體為流動相，采用高壓輸液系統，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，柱內各成分被分離后，進入檢測器進行檢測，從而實現對試樣的分析[2]。為此，本文就高效液相色譜法（HPLC）測定葡萄酒中白藜蘆醇含量進行分析和研究。

1 儀器與試劑

①儀器：美國Agilent 1100高效液相色譜儀，二極管陣列DAD檢測器、上海光譜SP765P紫外可見分光光度計，四元及真空脫氣泵、賽多利斯BSA224S電子分析天平、自動進樣器、Bolong超清清洗機、一次性濾器（0.45 μm）、濾膜、PHS-25pH計等。②試劑與標準品：標準對照品白藜蘆醇（純度98%）由中國藥品生物制品檢定所提供；葡萄酒：寧夏西夏王葡萄酒業有限公司市售的2014年份西夏王干紅（赤霞珠）、西夏王干白（貴人香及霞多麗），乙腈、甲醇為色譜純，乙醇為國產分析純，超純水等，均為天津科密歐化學試劑有限公司產品。

2 方法與結果

2.1 制備標準品及供試品溶液

精密量取標準對照品白藜蘆醇10 mg，將其置于10 mL甲醇中充分溶解制成1 mg/mL乙醇溶液（儲備液），精密量取適量置于甲醇中溶解并稀釋制成1 mg/mL的標準品溶液，置于冰箱低溫（4 ℃）保存待用，HPLC分析前，采用一次性有機濾器濾過處理，采用超聲除去氣泡，時間30 min。另取適量不同品牌干紅及干白葡萄酒經濾膜（0.45 μm）過濾待用。

2.2 色譜條件

色 譜 柱，Agilent 1100-C18柱（4.6 mm×250 mm，10 μm）；流動相，乙腈-水（體積比為70∶30）；柱溫，30 ℃；檢測波長，306 nm；流速，1.0 mL/min；進樣量，10 μL。色譜圖如圖1所示。

圖1 樣品中白藜蘆醇的色譜圖

2.3 線性關系

分別精密吸取不同質量濃度的儲備液注入液相色譜儀內，于上述色譜條件下分析、測定峰面積。其中縱坐標、橫坐標分別為峰面積、對照品溶液含量，分析后得到回歸方程[3]：Y（葡萄酒白藜蘆醇峰面積）=19 970.67X-1 182.13（X為葡萄酒白藜蘆醇含量），線性相關系數r=0.999 8。葡萄酒中白藜蘆醇在0.227～45.003 μg范圍內峰面積與各自含量保持著良好線性關系，其中分別利用3倍、10倍信噪比進行檢測，結果檢測限、定量限分別為0.074 7、0.228 μg/mL。

2.4 穩定性及加樣回收率試驗

取標準品溶液7.5μg/mL，參照2.1方法分別于0、1、3、5、8、12 h各進樣10 μL進行含量測量，共測量6次，分別記錄峰面積[4]，結果顯示白藜蘆醇峰面積的相對標準偏差（RSD）值為2.25%，其在12 h內的穩定性均較好。另取標準品溶液5份，分別加入7.5 μg/mL白藜蘆醇標準品，參照2.1方法每次進樣10 μL，結果顯示葡萄酒白藜蘆醇的平均加樣回收率為97.10%，準確度較高。

2.5 精密度試驗

精密吸取標準品溶液1.875、7.5、45 μg/mL參照2.1方法于同等色譜條件下重復進行8次以上試驗，記錄各次峰面積。通過分析，白藜蘆醇峰面積RSD均＜2.0%，精密度良好。

3 討論

3.1 溶劑于檢測波長選擇

將白藜蘆醇分別溶于水、乙醚、乙醇及乙腈水中，經濾膜濾過后采用進樣器取配好適量溶液注入進樣閥，定量10 μL，采用HPLC法對葡萄酒中的白藜蘆醇進行檢測，結果顯示標準對照品峰面積與溶劑呈正相關性。經分光光度計掃描分析顯示，白藜蘆醇在檢測波長為306 nm時的吸收峰較大，故本文于HPLC法下選用306 nm作為檢測波長。

3.2 流動相選擇

本文采用不同比例的乙腈水溶液進行預實驗，結果提示二者按照體積比為70∶30混合、提取、脫脂后經液相色譜儀下檢測出的干擾成分最少，脫脂效果最佳。70∶30的乙腈水進行于流速1 mL/min，HPLC法下檢測白藜蘆醇，結果顯示標準品峰面積與實驗流動相的呈較好的正相關性，即其峰面積越大，流動相越好。其中在Agilent 1100-C18柱（4.6 mm×250 mm，10 μm）色譜柱，檢測波長306 nm，流動相乙腈-水，柱溫30 ℃，，流速1.0 mL/min，進樣量10 μL。

4 結語

白藜蘆醇是存在于葡萄皮中的一種非類黃酮天然活性物質，是葡萄在應激霉菌的感染和作用下所產生的具有降血脂、抗氧化以及降低血液黏稠度的保健效果。白藜蘆醇微溶于水，但易溶于乙醇，葡萄酒的制備過程主要有干紅和干白兩種工藝，其中干紅葡萄酒是指將葡萄進行帶皮發酵，因此在發酵過程中，白藜蘆醇能夠通過乙醇的浸提而從葡萄皮中轉移到葡萄醪中；干白葡萄酒的制備是利用純汁進行發酵，這使得富含白藜蘆醇的葡萄皮與葡萄汁被早早分離，故市場上將白藜蘆醇質量濃度的測定結果作為葡萄酒品質衡量和評價的重要指標之一。

目前，對于白藜蘆醇的檢測方法多種多樣，如毛細管電泳法、薄層層析法、氣相色譜法、液相色譜法及色質聯用等。但通過本研究的實驗設計以及實驗結果，高效液相色譜法不僅操作便捷，而且耗時較短，結果準確，因此適用于葡萄酒中白藜蘆醇含量的測定。