酶解法檢測淀粉糊化度的方法優化

The Optimization of Starch Gelatinization Enzyme Hydrolysis Method

◎ 劉 流1，周小波2

（1.鹽城市食品藥品監督檢驗中心，江蘇 鹽城 430070；2.天邦食品股份有限公司，浙江 寧波 315000）

淀粉糊化是指淀粉懸浮液在一定溫度下，淀粉顆粒吸水膨脹，體積增大，淀粉顆粒破裂，成為黏稠狀膠體溶液的過程。糊化的本質是淀粉中晶質與非晶質態的淀粉分子間的氫鍵斷開，微晶束分離，形成一種間隙較大的立體網狀結構，淀粉顆粒中原有的微晶結構被破壞[1]。糊化度是指淀粉中糊化淀粉與全部淀粉量之比的百分數。淀粉的糊化度越高，越容易被酶水解，越易被消化吸收[2]。

淀粉糊化度及糊化參數的測定，一般是根據淀粉糊化后其物理或化學特性的變化特點，如雙折射現象消失、顆粒膨脹、透光率及黏度變化等。目前，主要的研究方法有酶水解法、黏度測定法、雙折射法、DSC技術、近紅外光譜分析技術、X-衍射以及核磁共振光譜技術等[3]。本文主要討論酶解法，對比復合淀粉酶和單一酶β-淀粉酶的檢測結果。

1 材料與儀器

1.1 供試材料

玉米淀粉，北京鴻潤寶順科技有限公司，純度為99.5%。

1.2 試劑

β-淀粉酶：北京鴻潤寶順科技有限公司，效價為10.0萬/g。Sigma淀粉脫支酶（amyloglucosidase）：Sigma，No.A-7255，濃度為12 100單位/g。碘化鉀（KI）：分析純，國藥滬試。碘單質（I2）：分析純，國藥滬試。氫氧化鈉（NaOH）：分析純，國藥滬試，粒狀。硫代硫酸鈉（Na2S2O3·5H20）：分析純，國藥滬試。

1.3 儀器

分析天平（0.000 1 g），水浴鍋，電爐，100 mL三角瓶，10 mL酸式滴定管，燒杯，玻璃棒，100 mL棕色容量瓶，100 mL容量瓶，500 mL容量瓶，1 000 mL容量瓶。

2 原理

2.1 β-淀粉酶酶解法基本原理

葡萄糖和碘單質反應，消耗部分碘；硫代硫酸鈉滴定剩余部分碘；已知加入的碘的量，計算出消耗了多少碘，和麥芽糖的量。β-淀粉酶對糊化淀粉和原淀粉有較高選擇性，僅水解糊化淀粉，不水解生淀粉；根據β-淀粉酶將糊化淀粉水解為麥芽糖，已知麥芽糖的量，計算糊化淀粉的量，糊化淀粉與全部淀粉的量之比即為糊化度。經過不同標準品驗證，β-淀粉酶酶解法可以準確測量復合淀粉的糊化度。

2.2 涉及的化學反應

I2與NaOH作用可生成次碘酸鈉（NaIO），次碘酸鈉可將還原糖分子中的醛基定量地氧化為羧基。未與還原糖作用的次碘酸鈉在堿性溶液中歧化生成NaI和NaIO3，當酸化時NaIO3又恢復成I2析出，用Na2S2O3標準溶液滴定析出的I2，可計算出還原糖的含量。具體反應式如下，

C6H12O6和NaIO定量作用：

總反應式：I2+C6H12O6+2NaOH=C6H12O7+2NaI+H2O

C6H12O6作用完后，過量的NaIO發生歧化反應：

在酸性條件下NaIO3和NaI作用：

析出過量的碘用Na2S2O3標準溶液滴定：

2.3 淀粉糊化度的計算

公式中，X：糊化度；Q：空白試驗所消耗的硫代硫酸鈉標準溶液的體積，單位為mL；P1：糊化完全時所消耗的硫代硫酸鈉標準溶液的體積，單位為mL；P2：待測試樣所消耗的硫代硫酸鈉標準溶液的體積，單位為mL。

3 實驗方法

3.1 材料與試劑

（1）1%淀粉溶液。取可溶性淀粉0.5 g，加水5 mL攪拌均勻后，緩緩傾入100 mL沸水中，邊加邊攪拌，繼續煮沸2 min，放冷后傾取上層清液即得。

（2）1 mol/L鹽酸。量取8.34 mL37%濃鹽酸，加蒸餾水定容至100 mL。

（3）0.1 mol/L碘液。稱取碘化鉀3.5 g，溶于10 mL水中，然后稱取碘單質1.27g溶于碘化鉀溶液，充分溶解混勻后，轉入棕色容量瓶定容至100 mL（保質期1個月）。

（4）0.2 mol/L NaOH溶液。稱取4 g NaOH，加蒸餾水定容至500 mL。

（5）10%硫酸溶液。量取10 mL98%濃硫酸，加蒸餾水定容至100 mL。

（6）0.1 mol/LNa2S2O3溶液。稱取26 g硫代硫酸鈉（Na2S2O3·5H20），加0.2 g無水碳酸鈉，溶于1 000 mL水中，煮沸10 min，冷卻，放置一周后過濾，定容至1 000 mL。

3.2 β-淀粉酶酶解法

（1）通過60目篩磨碎試樣，分別稱取0.5 g（如有需要進行脫糖脫脂處理）置于2個100 mL的三角瓶中，分別標記A1、A2，另取1個100 mL的三角瓶，不加試樣作空白，標記為B。向這3個瓶中加入蒸餾水50 mL。

（2）把A1置于電爐煮沸（微）或沸水浴中煮沸60 min，每15 min搖勻一次，然后將A1三角瓶迅速冷卻到20 ℃（夏天高溫時應將A2、B與A1一起迅速冷卻到20 ℃）。

（3）在A1、A2、B中各加入0.150 gβ-淀粉酶，在38 ℃水浴中保溫3 h，每15 min攪拌1次，然后在3個三角瓶中迅速加入2 mL 1 mol/L的鹽酸溶液，用蒸餾水定容到100 mL，過濾后作檢定液用。

（4）各取檢測液20 mL，分別置于3個100 mL具塞磨口三角瓶中，各加入0.1 mol/L的碘液10 mL，0.2 mol/L的NaOH溶液10 mL，然后加塞暗處靜置15 min。注意：碘液不同批次不能混用；加入碘液后至滴定結束，保證每個樣品實驗時間一致。

（5）靜置后在上述3個三角瓶中各加入10%的硫酸溶液2 mL，用0.1 mol/L Na2S2O3的標準溶液進行滴定，待試樣顏色變為淡黃色時加入1%淀粉液指示劑，繼續滴定至藍色消失，記錄所消耗Na2S2O3標準溶液的體積。

3.3 注意事項

①碘液不同批次不能混用。②加入碘液后至滴定結束，保證每個樣品實驗時間一致。③脫糖脫脂處理步驟。取樣品50 g倒入250 mL三角瓶中，加入100 mL乙醚溶解后震蕩1 min后過濾（重復3次），加入100 mL乙醇溶解后震蕩1 min后過濾（重復3次）。將濾紙中樣品倒入三角瓶中，通風櫥內放置1 h后放入45 ℃烘箱，4 h后取出。

4 結果與分析

4.1 不同酶解時間玉米（顆粒生玉米）的糊化度檢測

使用Sigma復合酶測量糊化度為0的玉米淀粉，Sigma淀粉復合酶添加量為1% 4 mL。不同的酶解時間進行對比，實驗結果見表1。從表中數據可以看出，由于Sigma復合淀粉會緩慢水解生淀粉，故檢測結果與實際差別較大，且實驗得到的淀粉糊化度結果會隨酶解時間的增加而增加。

表1 復合淀粉酶檢測結果表

4.2 不同熟玉米淀粉比例的玉米淀粉的糊化度檢測

首先制備不同糊化度的玉米淀粉標準品，分別為0%、20%、40%、60%、80%和100%，進行驗證實驗。每份樣本中添加0.150 0 g的β淀粉酶，然后進行充分酶解，酶解時間為140 min，實驗結果見表2。從表中數據可以看出，淀粉糊化度的檢測結果比較準確，基本與標準品數據一致。

表2 β淀粉酶檢測結果表

5 結論

實驗驗證了淀粉復合酶可以比較緩慢的分解生淀粉，從而影響檢測糊化度的實驗結果，酶解時間越長，結果數據越大。而β-淀粉酶完全不水解生淀粉，經標準品實驗驗證，采用β-淀粉酶進行充分酶解后，可以得到較準確糊化度結果，比復合酶的傳統方法檢測結果更準確；且β-淀粉酶的新方法成本較低。因此β-淀粉酶可以廣泛應用于飼料質控檢測，食品質控檢測等領域。