高產GSH果酒酵母的篩選及對蘋果酒褐變的抑制

徐菁苒 ，毛 健 *， 劉雙平 ，周志磊

(1.糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，江南大學，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 食品學院，江蘇 無錫214122）

蘋果酒是用蘋果汁發酵制得的一種營養豐富、低酒精度的發酵制品，是僅次于葡萄酒的第二大果酒。蘋果酒富含氨基酸、維生素、礦物質以及鈣、鐵、磷、鉀等成分，不僅口感醇厚，酒香協調，且具有一定保健功效[1]。褐變是蘋果酒生產與貯存過程中的一個重要問題，既影響酒體色澤、酒質和風味，又會造成一些營養物質的損失[2-3]。褐變的實質是蘋果及蘋果酒中的多酚物質發生氧化，在生產過程中，既存在酶促褐變又有非酶促褐變[4-5]。目前，抑制果酒褐變主要有物理、化學2種方法，其中在釀造及貯存過程中普遍應用的一種化學添加劑就是SO2，SO2雖具有很好的抗氧化性，但大量研究結果表明，它對人體健康會產生很大的危害[6-7]。隨著社會發展，健康觀念已越來越深入人心，人們對化學合成抑制劑的安全疑慮日益增加[8]，為此，找到替代SO2的天然抗氧化物質，并利用生物方法達到抑制褐變的效果，已經成為果酒行業的研究熱點。

谷胱甘肽（GSH）是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸縮合形成的三肽化合物，具有抗氧化、清除自由基、解毒等生理功能[9-10]。目前，利用微生物的物質代謝進行GSH生物合成已得到廣泛的應用，發酵法生產GSH所用的菌種以釀酒酵母最為常見，主要通過γ-谷氨酰循環進行代謝[11]。因此，具有高GSH合成能力的菌株是提高GSH合成效率的關鍵。研究表明，GSH具有抑制果酒褐變的功效，表現出較強的抗氧化性[12]。而作為酵母菌的代謝產物，在不引入外源物質的前提下，通過篩選一株高產GSH的果酒酵母，利用微生物代謝抑制蘋果酒在發酵過程中的多酚褐變，從而減少SO2等抗氧化劑的使用。

本文中探究了GSH對多酚褐變的抑制效應，并以14株果酒酵母作為實驗材料，篩選出一株高產GSH的酵母菌株Y-18，該菌株能在降低果酒褐變值的同時保持較好的發酵特性。此研究利用生物方法減少褐變對果酒品質的影響，為高品質果酒的開發提供參考，在提高果酒安全性的前提下降低成本，具有廣闊的研究前景。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 原料 新鮮富士蘋果，購自市場，4℃保藏，使用前在25℃室溫放置2 h。

1.1.2 酵母菌株 01號（31814菌株）、02號（31906菌株）、03號（31693菌株），購自中國工業微生物菌種保藏管理中心；04#號 （2.2076菌株）、05#號（2.3848 菌株）、06# 號（2.2084 菌株）、07# 號（2.3851菌株），購自中國普通微生物菌種保藏管理中心；Y1401、Y1402、Y1403、Y-18、Y-RW、Y-SY、Y 菌株，實驗室保藏菌株，14株酵母菌均為釀酒酵母屬（Saccharomyces cerevisiae）。

1.1.3 主要試劑 葡萄糖、酵母膏、蛋白胨、瓊脂粉、硫酸銨、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、無水乙醇、檸檬酸、三氯乙酸、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、乙酸鈉、磷酸、抗壞血酸、亞硫酸鈉購自國藥集團；5，5'-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）、L-半胱氨酸、谷胱甘肽，購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.1.4 主要儀器 Waters 2695型高效液相色譜儀，沃特世（Waters）科技有限公司產品；立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博迅實業有限公司醫療設備廠制造；榨汁機，蘇泊爾股份有限公司產品；恒溫培養箱，上海森信實驗儀器有限公司產品；恒溫搖床，上海合恒儀器設備有限公司產品；7230G可見分光光度計，上海佑科儀器儀表有限公司產品；HG101-2電熱恒溫鼓風干燥箱，上海森信實驗儀器有限公司產品；冷凍離心機，德國eppendorf公司產品；FA2004N電子分析天平，梅特勒-托利多愛儀器（上海）有限公司產品；HH-S2系列恒溫水浴鍋，上海百典儀器設備有限公司產品；KQ-700E型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司產品；85-2型恒溫磁力攪拌器，上海司樂儀器有限公司產品。

1.2 培養基

1.2.1 YPD固體培養基 酵母粉10 g/L，魚粉蛋白胨 20 g/L，葡萄糖 20 g/L，瓊脂 20 g/L；pH自然，0.1 MPa滅菌15 min。

1.2.2 YPD液體培養基 酵母粉10 g/L，魚粉蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L；pH自然，0.1MPa滅菌15min。

1.2.3 搖瓶培養基 葡萄糖30 g/L，酵母粉10 g/L，硫酸銨6 g/L，磷酸氫二鉀3 g/L，磷酸二氫鉀0.5 g/L，硫酸鎂0.1 g/L；0.1 MPa滅菌15 min。

1.2.4 蘋果汁活化培養基 調節蘋果汁糖度為20°Brix，用檸檬酸調整培養基pH 3.5，酵母菌接種體積分數為5%，在25℃下發酵培養24 h。

1.2.5 蘋果汁發酵培養基 調節鮮榨蘋果汁糖度為20°Brix，調整培養基pH 3.5，酵母菌按體積分數5%的接種量接入蘋果汁，在25℃下發酵。

1.3 實驗方法

1.3.1 GSH對鮮榨蘋果汁褐變的抑制效果 新鮮蘋果，經自來水清洗、去核、切塊、榨汁、離心、過濾后，分別加入抗氧化劑GSH、抗壞血酸（VC）、L-半胱氨酸（L-cys）、二氧化硫（SO2），濃度分別為 0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mmol/L。以空白為對照，立即測定試樣品在420 nm下的光密度值（OD值）；其余樣品倒在培養皿，敞口放置在室溫下以便充分氧化褐變，24 h后測定各試樣OD420值。褐變值的變化率表示不同抗氧化劑對鮮榨蘋果汁褐變的抑制效果，每個試樣3次重復，取平均值。

式中，A0為 0 h OD420值；A1為 24 h 后 OD420值；A2為△OD420值；I為△OD420變化率。

1.3.2 果酒酵母發酵力測定 挑取酵母菌斜面種子一環接種于YPD液體培養基中，30℃搖瓶振蕩培養24 h，作為種子液。將種子液按10%接種體積分數接種到YPD液態發酵培養基中，在25℃靜態發酵，每隔24 h稱一次質量，計算各株酵母菌發酵時產生CO2的質量。

1.3.3 果酒酵母耐受性測定 分別以不同乙醇和pH值作為酵母菌生長和發酵的影響因素，通過測定發酵24 h后發酵液的OD600值，比較14株釀酒酵母在不同影響因素中的耐受性[13]。

1.3.4 果酒酵母產GSH能力測定 將種子液以10%的接種體積分數接種于pH 3.5和pH 6.5的搖瓶培養基中，在30℃、150r/min搖床中振蕩培養48h，測定生物量、酵母發酵液及胞內GSH的質量濃度。

1.3.5 果酒酵母發酵性能測定

1）果汁培養基調配

分別用蔗糖和1 mol/L的蘋果酸調節果汁糖度為 20°Brix，pH 值為 3.5。

2）蘋果酒發酵

取500 mL的三角瓶，加入400 mL蘋果汁，按5%的接種體積分數接入酵母種子液，在25℃下恒溫發酵，發酵初期微晃瓶體，使附著在瓶壁的酵母脫落，在發酵過程中每天取樣測定理化指標，當渣完全沉淀且無氣泡產生時則認為發酵結束。

1.4 測定方法

1.4.1 HPLC法測定發酵液中GSH質量濃度

1）色譜條件：色譜柱：Athena C18-WP，流動相為0.05 mol/L pH 5.6醋酸鈉緩沖液和甲醇（V/V=90∶10），流速為 1.0 mL/min，紫外檢測波長 330 nm，進樣量 20 μL，柱溫 40.0 ℃[14]。

2）樣品處理：取1 mL樣品，加入1 mL 10%三氯乙酸，在轉速10 000 r/min下離心8 min，沉淀蛋白質。取1 mL上清液，加入0.5 mL 500 μmol/L pH 8.0的Tris-HCl溶液，混合均勻，加入20 μL純水，再加入0.5 mL 0.01 mol/L DTNB，振蕩均勻，室溫反應5 min，再加入0.1 mL 7.0 mol/L磷酸溶液酸化，10 000 r/min離心8 min，上清液用0.22 μm微孔濾膜后進行HPLC分析[14]。

1.4.2 菌體生物量測定 將25 mL菌體培養液倒于已知重量的干凈離心管中，在轉速8 000 r/min離心10 min后棄去上清液，并加入適量蒸餾水洗滌2次，置于干燥箱中在105℃下烘干至恒重，總質量與離心管質量量之差即菌體干重，由此計算培養液的菌體生物量。

1.4.3 胞內GSH質量濃度測定 取10 mL發酵液，在轉速8 000 r/min離心10 min后棄去上清液，收集菌體。加入適量蒸餾水洗滌2次后，加入10 mL 40%乙醇溶液，振蕩器混合均勻，室溫下抽提2 h，在轉速8 000 r/min離心10 min得上清液，稀釋后進行HPLC測定[15]。

1.4.4 發酵液色度的測定 取果汁或果酒發酵液，于8 000 r/min下離心10 min，將上清液在420 nm波長處測定吸光度，以吸光度值表示色度[16]。

1.4.5 果酒理化指標測定 還原糖、酒精度參照GB/T 15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》測定。

甘油質量濃度測定：高效液相色譜法[17]。

2 結果與分析

2.1 GSH對多酚褐變的抑制效果

以鮮榨蘋果汁為研究對象，以VC、L-cys及SO2為對照，探討GSH對多酚褐變的抑制效果，試驗結果見圖1。可以看出，作為應用最廣泛的化學添加劑，SO2表現出最強的抑制作用。但大量研究結果表明，SO2對人體健康會產生很大的危害，這一缺點在一定程度上限制了它的使用。VC的抑制褐變效果較差，VC極易氧化分解，又可與游離氨基酸反應，生成色素，隨著時間的延長，反而會使色澤加深[18]。L-cys對蘋果汁的抑制效果稍優于VC，但加入L-cys后，果汁中的氨基酸含量增加，加重了美拉德反應，果汁顏色有變紅的趨勢，限制了L-cys的應用。

圖1 不同抗氧化劑對鮮榨蘋果汁褐變的影響Fig.1 Effect of different antioxidants on browning degree of fresh apple juice

由圖可知，GSH對蘋果汁褐變的抑制效果僅次于SO2，且隨著濃度的增加，褐變度趨于線性降低。GSH由于含有巰基而具有還原性，可以抑制果汁及果酒褐變。在引起褐變的酶促氧化過程中，GSH對多酚氧化酶的活性有一定抑制作用，在一定程度上抑制了酶促氧化。GSH可結合酚類物質氧化后生成的醌，形成無色的羥醌類物質，降低了果汁及果酒的褐變度[18]。GSH作為一種具有抗氧化、清除自由基作用的天然酶促褐變抑制劑，可用其代替傳統化學抗氧化劑SO2用于蘋果汁及蘋果酒釀造生產。

2.2 高產谷胱甘肽果酒酵母的篩選

2.2.1 酵母菌株發酵力比較 酵母菌的發酵力是反映酵母對各種糖類的發酵能力的重要指標。以CO2失重量為指標衡量酵母菌的發酵速率，是衡量酵母產酒能力的一個重要指標。14株釀酒酵母菌株發酵力結果見圖2，由圖可見，14株釀酒酵母的發酵能力有顯著差別，試驗菌株 Y1401、01、Y-18、06#的發酵力較強于其它菌株，且在第4天CO2失重量達到最大，之后趨于平緩。

圖2 不同酵母菌株發酵力Fig.2 Fermentation capacity of different yeasts

2.2.2 酵母菌耐乙醇能力比較 一般來說，酵母細胞的發酵能力與菌株對酒精的耐性成正相關。由圖3可知，不同酵母菌對乙醇的耐受性不同，隨著培養基中乙醇濃度的增加，酵母菌發酵液的OD600值不斷降低，在乙醇濃度大于10%時，酵母細胞的生長受到了很大抑制。從整個變化趨勢來看，耐乙醇能力較強的酵母菌為 01、06#、Y1403、Y-18、02 菌株。

圖3 不同乙醇濃度下酵母的耐受性Fig.3 Tolerance ofyeastsunder differentethanol concentration

2.2.3 酵母菌pH耐受性 隨著培養基pH值的降低，14株釀酒酵母的生長能力整體呈下降趨勢，在pH 2.0～3.0之間，酵母菌的生長受到很大程度抑制，由于此范圍并不是蘋果酒釀造的最適pH范圍，所以不會對蘋果酒發酵產生不良影響，見圖4。Y-18對pH的耐受性較強，OD值的波動較平緩，這說明Y-18菌株對酸性環境的適應能力較強于其它菌株。

圖4 不同pH值下酵母菌的耐受性Fig.4 Tolerance of yeasts to pH

2.2.4 酵母菌產GSH能力分析 對14株釀酒酵母的生物量和產GSH能力進行測定，結果發現不同酵母菌產GSH能力有較大差別，且pH對發酵液中GSH的質量濃度影響較大。pH是微生物生長的一個重要的環境條件，對微生物的生長、發育以及代謝過程都有很大的影響。當細胞處于不正常的環境中時，出于保護自身的本能和抵御外界環境傷害的需要，細胞可能會對其代謝產物的合成和分泌做出調整。研究表明，GSH在微生物抵抗酸脅迫過程中具有積極作用[19]。蘋果酒發酵pH為3.2～4.2，當酵母細胞遭遇低pH脅迫時，細胞能以增加GSH合成并向胞外分泌GSH的方式來響應和抵御外界pH的不斷降低。

由表1可以看出，在pH 3.5條件下，酵母菌發酵液中的GSH質量濃度顯著高于pH 6.5時的GSH質量濃度，說明酸性環境刺激了酵母菌向胞外分泌GSH能力，而不同酵母細胞對外界環境的響應能力差異較大。在pH 3.5條件下，發酵液中GSH質量濃度及胞外胞內GSH質量濃度較高的菌株為Y-18、03、04#、01、02、RW、06#、07# 菌株，其中 Y-18 及 03菌株發酵液的GSH質量濃度顯著高于其它菌株。目前，針對GSH胞外釋放的研究較少，促進GSH向胞外分泌的方法主要有2種：脅迫控制及表面活性劑處理。冮潔[20]等研究發現，在加入0.3%Triton X-100后，胞外GSH質量濃度最高可達到29.03 mg/L，但細胞生長受到了很大程度的抑制，釀酒酵母Y-18在未經表面活性劑處理的條件下GSH胞外質量濃度達到29.5 mg/L，表現出一定的優越性。

表1 不同酵母菌株生物量及GSH質量濃度的比較Table 1 Comparison of biomass and GSH content among different yeast strains

綜合考慮酵母菌的發酵力、耐受性及產GSH能力，篩選釀酒酵母Y-18作為高產GSH的果酒酵母菌株，該菌株在蘋果酒發酵pH范圍內有優良的發酵性能，產GSH能力顯著強于其它菌株。

2.3 高產GSH果酒發酵蘋果酒的性能測定

2.3.1 發酵過程中還原糖、乙醇的變化 對Y-18菌株和4株發酵力或產GSH能力較強的對照菌03、04#、06#、02進行蘋果酒發酵試驗，從圖5可以看出，酵母菌在前4 d還原糖量迅速下降，酒精分數近似線性增長，主發酵進行到第5天后還原糖量和酒精分數趨于平緩。通過與對照菌株比較可以發現，03菌株發酵能力較弱，不適合蘋果酒發酵，而Y-18菌株的發酵度平緩，能更好地防止雜菌污染，發酵結束后酒精度達到11%左右，是優良的酵母菌種。

圖5 發酵過程中的還原糖、酒精度變化曲線Fig.5 Curve of reducing sugar and alcohol concentration in fermentation

2.3.2 發酵過程中甘油質量濃度的變化 甘油是酵母菌酒精發酵過程中的副產物，具有甜味，可用于平衡酒中的酸感，增加口感復雜性，是高品質果酒的重要成分。由圖6可知，酵母菌在第1天甘油質量濃度迅速增加，之后波動較小。菌株Y-18發酵結束后，發酵液中甘油質量濃度為5.6 g/L，約為對照菌的1.5～2倍。研究表明，當酵母細胞處于高滲透壓環境時，甘油被誘導合成以提高胞內滲透壓，其對細胞中的酶和生物大分子的結構進行較大程度的保護。因此，發酵過程中能生產甘油的酵母通常具有一定的滲透壓耐受能力[21]。

圖6 發酵過程中的甘油質量濃度變化曲線Fig.6 Curve of glycerin content in fermentation

2.3.3 發酵過程中色度的變化 在果酒發酵過程中，既有酶促褐變又有非酶促褐變。酶促褐變主要發生在果酒發酵的前期，參與酶促褐變的酶主要是多酚氧化酶（PPO），它能催化酚類物質氧化成醌類物質，醌類物質易進一步聚合形成黑色素。非酶促褐變主要有美拉德反應、焦糖化反應、抗壞血酸氧化分解反應、多元酚氧化縮合反應等[22]。

蘋果酒發酵液的色度變化如圖7所示。隨著發酵時間的推移，4株對照菌發酵液的色度呈先下降后趨于平緩的趨勢，Y-18菌株發酵液色度下降趨勢顯著。在發酵過程中，Y-18菌株發酵液的色度維持在較低水平，在第5天色度降低40.4%，發酵結束后色度顯著低于其余對照菌株。

圖7 發酵過程中的色度變化曲線Fig.7 Curve of color value in fermentation

2.3.4 發酵過程中GSH質量濃度的變化 在蘋果酒發酵過程中，發酵液中GSH質量濃度處于動態變化中，GSH主要由酵母菌代謝產生，其參與發酵過程中的抗氧化過程，GSH可結合酚類物質氧化后生成的醌，形成無色的羥醌類物質，對果酒褐變的抑制及抗氧化性的提高影響顯著。由圖8可以看出，不同酵母菌發酵液的GSH質量濃度各不相同，但趨勢較為一致，在第2天，GSH質量濃度達到最高值。研究表明，不同酵母菌發酵的果酒GSH質量濃度差異較大，Giuseppe[23]等對發酵結束的白葡萄酒中的GSH質量濃度進行測定，發現其質量濃度僅為0～2 mg/L，且隨著陳化時間的延長逐漸減少。Y-18菌株在發酵過程中發酵液的GSH質量濃度最高可達14.39 mg/L，具有明顯的優勢。發酵結束后Y-18菌株發酵蘋果酒的GSH質量濃度為5.82 mg/L，顯著高于其它對照菌株。

圖8 發酵過程中的GSH質量濃度變化曲線Fig.8 Curve of GSH content in fermentation

2.3.5 不同酵母菌發酵蘋果酒的感官特征

不同酵母發酵蘋果酒的感官分析見表2。

表2 不同酵母菌發酵蘋果酒感官分析Table 2 Organoleptic evaluation of the cider brewed by different yeast strains

3 結語

考察了GSH對多酚褐變的抑制效應。結果表明，與常用護色劑 SO2、VC、L-cys相比，GSH 抑制蘋果汁褐變能力優于VC和L-cys，是一種很強的還原劑。

以14株果酒酵母為備選菌株，比較了酵母菌的發酵力、耐酒精、耐pH能力，結果表明，菌株Y1401、01、Y-18、06# 的發酵力較強。 耐乙醇能力較強的酵母菌為 01、06#、Y1403、Y-18、02 菌株。pH 是微生物生長的一個重要的環境條件，在pH 2.0～3.0之間，酵母菌的生長受到一定程度抑制，而Y-18菌株對pH的耐受性較強，對酸性環境的適應能力較強于其它菌株。

通過對14株釀酒酵母產GSH能力進行比較，結果發現，在pH 3.5條件下，酸性環境刺激酵母菌向胞外分泌GSH，發酵液中GSH質量濃度及GSH質量濃度較高的菌株為 Y-18、03、04#、01、02、YRW、06#、07#，其中Y-18及03菌株發酵液的GSH質量濃度顯著高于其它菌株。綜合以上指標，選擇Y-18作為高產GSH的果酒酵母菌株，用于蘋果酒發酵試驗。

本試驗對Y-18菌株和4株發酵力或產GSH能力較強的對照菌 03、04#、06#、02進行蘋果酒發酵試驗。結果表明，Y-18菌株的發酵度平緩，發酵結束后酒精分數達到11%左右，是優良的酵母菌種。發酵過程中能生產甘油的酵母通常具有一定的滲透壓耐受能力，菌株Y-18發酵蘋果酒甘油質量濃度為5.6 g/L，約為其它菌株的1.5～2倍。隨著發酵時間的推移，4株對照菌發酵液的色度呈先下降后趨于平緩的趨勢，Y-18菌株發酵液色度顯著低于其它菌株。而GSH質量濃度在發酵過程中處于動態變化，在第2天達到最高值，Y-18菌株發酵液中GSH質量濃度最高達14.39 mg/L。

綜上，GSH對抑制多酚褐變具有較好的效果，而高產GSH果酒菌株Y-18能在降低果酒褐變值的同時保持良好的發酵特性，在提高果酒安全性的前提下利用生物方法減少褐變對果酒品質的影響，從而為高品質果酒的開發提供新的思路和參考。