乳源β-酪啡肽-7對老年小鼠肝臟氧化應激的影響

（揚州大學旅游烹飪學院烹飪與營養學系，江蘇 揚州，225000）

0 引言

生物體的衰老是一個極其復雜的生理過程，關于衰老的機理，國內外學者迄今已提出多種學說，其中Harman[1]提出的自由基學說具有代表性。機體存在直接清除自由基，抑制自由基的生成或是激活機體抗氧化體系的自由基清除劑，包括超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）等酶類清除劑。單胺氧化酶（monoamine oxidase,MAO）能夠催化內源性或外源性單胺類物質發生氧化脫氨反應，使其失去生理活性，作為抗氧化活力測定的輔助指標。而自由基攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，產生大量代謝產物丙二醛（malondialdehyde，MDA），可引起細胞代謝及功能障礙，加速機體衰老。

β-酪啡肽-7是一種來源于酪蛋白酶解的生物活性肽，已有研究顯示其具有免疫活性、阿片活性、促進激素分泌、促進生長及消化道發育等多種生物學功效[2-3]。杜偉等[4]發現牛乳中添加胰島素和酪蛋白酶解物可以提高IUGR仔豬肝臟的抗氧化功能。印虹等[5]發現β-CM-7可以通過顯著上調高血糖大鼠小腸黏膜SOD、GSH-Px等抗氧化應激酶的活性，對糖尿病大鼠小腸黏膜有一定的保護作用。另本組的初步研究結果顯示β-CM-7可以顯著調節老年小鼠的血脂，而肝臟是血脂調節的主要器官。所以本研究以老年小鼠為模型，通過測定老年小鼠肝臟SOD、GSH-Px、MAO活性及MDA含量，觀察β-酪啡肽-7對老年小鼠肝臟氧化應激的影響，為其進一步開發利用提供科學依據。

1.1 材料與儀器

雄性昆明小鼠，十月齡40只，二月齡10只，南京青龍山動物中心提供。

β-酪啡肽-7購自南京肽業生物科技有限公司，-20℃保存，用時以生理鹽水配制成相應濃度。單胺氧化酶（MAO）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、蛋白定量測試試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

755S紫外分光光度計（上海拜力生物科技有限公司），全波長酶標儀（美國Thermo Fisher公司），Allegra X-22R臺式冷凍離心機（美國Beckman Coulter公司），BSA224S電子分析天平（北京賽多利斯科學儀器有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組與處理

適應性喂養一周后，無不良反應，飲食飲水正常，體質量、體溫、被毛、大小便及活動正常者即納入實驗。按體重編號，分組如下：

（1）空白對照組：每天灌胃0.9%的生理鹽水0.5 mL,連續灌胃30 d。

（2）模型對照組：每天灌胃0.9%的生理鹽水0.5 mL,連續灌胃30 d。

（3）低劑量組：灌胃β-酪啡肽-7溶液2×10-7mol/d，連續灌胃30 d。

（4）中劑量組：灌胃β-酪啡肽-7溶液1×10-6mol/d，連續灌胃30 d。

（5）高劑量組：灌胃β-酪啡肽-7溶液5×10-6mol/d，連續灌胃30 d。

每天觀察，記錄小鼠活動、反應、進食、飲水、皮毛、糞便等情況。末次用藥后，禁食不禁水16 h。

1.2.2 樣品的采集與處理

小鼠頸椎脫臼處死，取肝臟、脾臟等組織，在預冷的PBS緩沖液中漂洗數次，濾紙吸干，稱取0.5 g左右的組織，－70℃保存。測定時，充分研碎制成10%肝組織勻漿，3 000 r/min離心15 min，取上清，待測。

1.2.3 測定指標與方法

分光光度法測定MDA含量，WST-1法測定SOD活性，二硫代二硝基苯甲酸比色法測定GSH-PX活性，紫外比色法測定MAO活性，具體步驟按試劑盒說明操作。臟器系數計算公式：臟器系數（%）=小鼠臟器濕重/體重×100。

1.2.4 數據處理

采用SPSS軟件。計量資料x±s，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA）,兩組間比較采用q檢驗，P＜0.05為差異具有統計學意義。

1 材料與方法

2 結果

2.1 β-酪啡肽-7對老年小鼠臟器指數的影響

表1 β-酪啡肽-7對小鼠臟器指數的影響（n=8）

臟器指數可以在一定程度上反映灌胃用藥對小鼠器官的影響情況，由表1可見，與空白對照組相比，模型對照組臟器指數有下降趨勢，但無顯著差異（P＞0.05）。與模型組相比，不同劑量組小鼠肝臟指數、脾臟指數有下降趨勢，但均無顯著差異（P＞0.05）。

表2 β-酪啡肽-7對小鼠肝臟抗氧化功能的影響（n=8）

2.2 β-酪啡肽-7對老年小鼠肝臟抗氧化功能的影響

與空白對照組相比，模型對照組SOD活性有升高趨勢，但差異不具顯著性；與模型組相比，低劑量組與高劑量組SOD活性有升高趨勢，其中高劑量組顯著升高（P＜0.05）。與空白對照組相比，模型對照組GSH-Px活性有升高趨勢，差異具有顯著性（P＜0.05）；與模型對照組相比，低、中、高劑量組GSH-Px活性有下降趨勢，差異不具顯著性。與空白對照組相比，模型對照組MAO活性有上升趨勢，但差異不具顯著性；與模型對照組相比，低、中、高劑量組MAO活性沒有顯著性差異。與空白對照組相比，模型對照組MDA含量有下降趨勢，差異不具顯著性；與模型對照組相比，低、中、高劑量組MDA含量均有升高趨勢，其中低劑量組差異極具顯著性（P＜0.01），高劑量組差異有顯著性（P＜0.05）。

3 討 論

老年人隨著年齡的增長，物質代謝異常，出現各種代謝綜合征[6]，影響老年人的生活質量。肝臟是機體物質代謝的中心，在糖、脂、蛋白質代謝中均具有重要的特殊作用。所以本研究選用肝臟作為觀察小鼠氧化應激狀態的器官。

臟器指數可以在一定程度上反映灌胃用藥對小鼠器官的影響情況，各組差異并不明顯，提示β-酪啡肽-7并未對小鼠造成不良影響。而與空白對照組相比，模型對照組臟器指數有下降趨勢但并不明顯，提示該實驗組老年小鼠未完全進入老化狀態。與李善如等[7]報道基本一致。

超氧化物歧化酶（SOD）與谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)是機體內重要的生物活性物質，能清除機體內過多的氧自由基，因而能防御氧毒性，保護細胞免受損傷，其活性高低能反應機體抗氧化能力的大小。β-酪啡肽-7對老年小鼠肝臟SOD、GSH-Px活性的影響見表2。高劑量組SOD顯著增高，提示較高計量的β-酪啡肽-7有提高老年小鼠肝臟抗氧化應激的可能。與韓東寧等[8]報道的結果基本一致。但本實驗未見劑量組GSH-Px活性有顯著性變化，與這與顧芳等[9]的研究有一定差異，這可能與本實驗干預時間較短有一定關系。

單胺氧化酶（MAO）的活性變化與機體衰老有密切關系,是一種與衰老正相關酶。其活性提高，單胺遞質分解增多，細胞代謝失調發生老化[10]。β-酪啡肽-7對老年小鼠肝臟MAO影響見表2。劑量組未出現顯著性變化，提示劑量組老年小鼠肝臟處于氧化應激的正常狀態。

丙二醛（MDA）是脂質過氧化產物，其含量的大小反映組織損傷程度，是老化的重要指標。β-酪啡肽-7對老年小鼠肝臟MDA含量影響見表2。低、高劑量組MDA含量顯著性增高，提示劑量組肝臟處于氧化應激的狀態。周艷[11]對酒精性脂肪肝小鼠進行為期八周的β-酪啡肽-7灌胃，測得小鼠肝臟MDA含量顯著降低（P＜0.01），綜合抗氧化酶系活性提高得出β-酪啡肽-7具有抑制小鼠肝組織脂質過氧化作用的結論。與本實驗MDA含量顯著增加有一定的差異，這可能與本實驗選用的實驗對象、實驗時間有一定的關系。

綜上所述，β-酪啡肽-7有提高老年小鼠肝臟抗氧化應激的可能，其機制可能與提高老年小鼠肝臟的超氧化物歧化酶活性有關。考慮到劑量組丙二醛含量的增高，超氧化物歧化酶抗氧化活性的提高能否真正作用于肝臟，提高老年小鼠肝臟的抗氧化應激能力有待進一步深入研究。