E-鈣黏蛋白基因啟動子區甲基化在卵巢子宮內膜異位癥中作用的研究

樊霞，安冬，李琰，康山*

子宮內膜異位癥是一種婦科常見疾病，5%～10%的育齡期婦女患有此病，且30%～50%伴有不孕［1］。目前該病的病因尚不十分清楚。子宮內膜異位癥雖然為良性病變，但具有類似惡性腫瘤的生物學行為，有活性的子宮內膜細胞遠端轉移、侵襲、黏附、生長，形成異位病灶。積累的證據顯示與腫瘤轉移、侵襲相關的基因在子宮內膜異位癥的形成中也起著重要作用［2-4］。

腫瘤抑制基因——E-鈣黏蛋白（E-cadherin）的異常表達與腫瘤細胞的增殖、去分化、侵襲和轉移均有密切關系。關于子宮內膜異位癥的研究也證明E-cadherin缺失的子宮內膜細胞具有轉移和侵襲能力［5］，且患者的在位、異位內膜可能存在著E-cadherin的異常表達［6］。

基因啟動子區的甲基化是一種重要的表觀遺傳學修飾，參與基因的表達調控。前期有研究證實在多種腫瘤細胞中E-鈣黏蛋白基因（CDH1）啟動子區的高甲基化是導致E-cadherin表達水平下調的重要原因［7-8］。本研究擬探討卵巢子宮內膜異位癥患者在位、異位內膜細胞CDH1啟動子區甲基化狀態，目的在于探討CDH1表觀遺傳學改變與卵巢子宮內膜異位癥發生的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 本研究納入50例卵巢子宮內膜異位癥患者和50例由于宮頸上皮內瘤變（CIN）Ⅲ級行子宮切除或子宮探查的患者（對照婦女）。均來自河北醫科大學第四醫院，納入時間為2011年10月—2013年8月。卵巢子宮內膜異位癥患者經腹腔鏡手術確診，均為Ⅲ～Ⅳ期［9］，年齡22～51歲，平均年齡（36.7±6.8）歲。對照婦女年齡26～55歲，平均年齡（38.5±3.8）歲。本研究經河北醫科大學第四醫院倫理委員會批準，研究對象均知情同意。

1.2 排除標準 排除合并子宮內膜病變、子宮肌瘤、內分泌疾病及術后病理證實合并其他卵巢良惡性腫瘤的患者。

1.3 標本采集 術中無菌采集卵巢子宮內膜異位癥患者的在位內膜（在位內膜組）、異位內膜（異位內膜組）及對照婦女子宮內膜組織（對照子宮內膜組），放入RNAlater溶液（Carlsbad，美國）中，-20 ℃保存。

1.4 DNA提取與甲基化特異性聚合酶鏈式反應（MSP）

在位內膜組、異位內膜組和對照子宮內膜組DNA采用Wizard?基因組DNA提取試劑盒（Promega，美國）提取。采用NanoDrop 1000 分光光度計（Thermo Fisher Scientific，美國）檢測所提取DNA的濃度。1 μg DNA采用BisulFlashTM DNA修飾試劑盒（Epigentek，美國）進行亞硫酸氫鹽修飾。修飾后的DNA使用MSP方法檢測CDH1啟動子區甲基化狀態。甲基化引物（M）：5'-GGTGTTTTAGTTAATTAGCCGGTAC-3'（上游）和5'-CATAACTAACCGA AAACGCCG-3'（下游）；非甲基化引物（U）：5'-GGTAGGTGAATTTTTA GTTAATTAGTGGTA-3'（ 上 游） 和5'-CCCATAACTAACCAAAAACACCA-3'（下游）（北京賽百盛生物工程有限責任公司，中國）。PCR擴增產物：甲基化為204 bp，非甲基化為211 bp。以甲基轉移酶處理的正常人外周血DNA為模板擴增的PCR產物為甲基化陽性對照標本（甲基化陽性組），正常人外周血DNA為模板擴增的PCR產物為甲基化陰性對照標本（甲基化陰性組），PCR時用水代替模板DNA所得的PCR產物為空白對照（見圖1）。

本文創新點：

本研究首次在人體組織中探討了E-鈣黏蛋白基因（CDH1）啟動子區甲基化與卵巢子宮內膜異位癥的關系。結果提示子宮內膜組織CDH1基因啟動子區異常甲基化所致的E-鈣黏蛋白異常表達可能在子宮內膜異位癥的發生中起重要作用。

圖1 CDH1啟動子區的甲基化狀態Figure 1 Methylation status of the CDH1 promoter

1.5 RNA提取和反轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）在位內膜組、異位內膜組和對照子宮內膜組CDH1 RNA采用Trizol試劑盒（Invitrogen，美國）提取。cDNA合成采用Promega反轉錄試劑盒。RT-PCR引物：（1）E-cadherin（314 bp）：5'-AGTGCCAACTGGACCATTCA-3'（上游）和5'-TCTTTGACCACCGCTCTCCT-3'（下游）；（2）GAPDH（452 bp）：5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'（上游）和5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'（下游）。PCR產物采用4%瓊脂糖膠檢測（見圖2）。

圖2 RT-PCR檢測內膜組織CDH1 mRNA表達Figure 2 Expression of CDH1 mRNA detected by PT-PCR

1.6 流式細胞術分析E-cadherin表達水平 將甲基化陽性組和甲基化陰性組子宮內膜組織制備成單細胞懸液，冷PBS沖洗2次后，將細胞懸浮在1 ml含有E-cadherin-FITC或isotype-FITC 抗體的PBS中，室溫避光30 min，PBS沖洗后重新懸浮在1 ml PBS中。采用FC500（Beckman Coulter，美國）流式細胞儀檢測E-cadherin表達水平（見圖3）。

圖3 流式細胞術檢測內膜組織E-cadherin表達水平Figure 3 Expression of E-cadherin protein detected by flow cytometry

1.7 統計學方法 采用SPSS 13.0統計軟件對所有資料進行統計分析。計量資料以（±s）表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；計數資料的比較采用χ2檢驗；相關性分析采用Pearson相關分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CDH1啟動子區甲基化狀態 在位內膜組CDH1啟動子區甲基化陽性率為26.0%（13/50），異位內膜組為32.0%（16/50），對照子宮內膜組為8.0%（4/50）。3組CDH1啟動子區甲基化陽性率比較，差異有統計學意義（χ2=9.09，P=0.011）；其中在位內膜組和異位內膜組CDH1啟動子區甲基化陽性率高于對照子宮內膜組，差異有統計學意義（χ2=5.74，P=0.017；χ2=9.00，P=0.003）；在位內膜組和異位內膜組CDH1啟動子區甲基化陽性率比較，差異無統計學意義（χ2=0.44，P=0.509）。

2.2 CDH1 mRNA表達水平比較 甲基化陽性組CDH1 mRNA的表達水平低于甲基化陰性組，差異有統計學意義（P＜0.05，見表1）。

2.3 E-cadherin表達水平比較 甲基化陽性組E-cadherin的表達水平低于甲基化陰性組，差異有統計學意義（P＜0.05，見表1）。

表1 甲基化陽性、陰性組CDH1 mRNA、E-cadherin表達水平Table 1 Expression of CDH1 mRNA and E-cadherin in methylationpositive and methylation-negative groups

2.4 CDH1 mRNA表達水平和E-cadherin表達水平的相關性 CDH1 mRNA表達水平和E-cadherin表達水平呈正相關（r=0.43，P=0.017）。

3 討論

3.1 CDH1異常甲基化與卵巢子宮內膜異位癥E-cadherin是一種鈣依賴性黏附分子，分布于各類上皮細胞，主要介導同種細胞間的黏附反應，維持細胞極性和參與分化調節，對維持組織結構形態和完整性起重要作用。其編碼基因CDH1被公認是腫瘤浸潤、轉移的抑制基因。上皮細胞中E-cadherin表達水平降低可能導致上皮細胞-間充質轉化（EMT）。通過EMT，上皮細胞失去了細胞極性、與基底膜的連接等上皮表型，獲得了較高的遷移與侵襲、抗凋亡和降解細胞外基質的能力等間質表型。因此，E-cadherin表達丟失在腫瘤的轉移、侵襲中起重要作用。子宮內膜異位癥患者的內膜細胞也存在著E-cadherin的異常表達。一些研究顯示子宮內膜異位癥患者子宮內膜腺上皮的E-cadherin表達水平明顯降低［10］，相反地，有研究發現患者的E-cadherin表達水平明顯高于對照婦女［11］。但體外研究顯示E-cadherin表達陰性的子宮內膜細胞具有轉移侵襲能力，E-cadherin表達陽性的子宮內膜細胞則不具有轉移侵襲能力［5］。因此E-cadherin表達丟失與子宮內膜細胞的轉移侵襲密切相關。

E-cadherin表達丟失的機制尚不明確，啟動子區的甲基化是基因失活的主要機制之一。前期的研究發現多種上皮性腫瘤組織中存在CDH1啟動子區的高甲基化，且異常甲基化所導致E-cadherin表達失活與腫瘤的轉移侵襲密切相關［12-14］。然而，有關子宮內膜異位癥中CDH1啟動子區甲基化的狀態及與E-cadherin表達關系的研究還十分有限。WU等［15］證實在2個永生化的子宮內膜異位癥的細胞系中，CDH1啟動子區為高甲基化狀態，細胞具有明顯的轉移侵襲能力；采用組蛋白脫乙酰酶抑制劑A處理細胞重新活化E-cadherin表達，細胞的侵襲轉移能力明顯降低。提示至少在子宮內膜異位癥細胞系中，CDH1啟動子區甲基化導致的E-cadherin表達陰性可能與子宮內膜細胞的轉移侵襲相關。本研究結果發現在位、異位內膜組CDH1啟動子區的甲基化陽性率明顯高于對照子宮內膜組，表明卵巢子宮內膜異位癥患者中存在著CDH1的異常甲基化。

3.2 CDH1啟動子區甲基化狀態與其在子宮內膜組織表達的關系 DNA甲基化是真核生物基因表達調控的重要方式之一，DNA甲基化可以在轉錄水平抑制基因的表達，且甲基化水平與基因的表達呈負相關。本研究采用RT-PCR和流式細胞術檢測了CDH1啟動子區內膜組織CDH1 mRNA、E-cadherin的表達水平，發現甲基化陽性組的CDH1 mRNA、E-cadherin的表達水平明顯低于甲基化陰性組。基于E-cadherin在卵巢子宮內膜異位癥中的作用，推測子宮內膜組織CDH1啟動子區的異常甲基化所導致的E-cadherin表達異常可能是卵巢子宮內膜異位癥發生的重要原因。

本研究結果可能為探討卵巢子宮內膜異位癥的發生機制提供重要的理論依據，也可能為卵巢子宮內膜異位癥的臨床治療提供新的思路。

作者貢獻：樊霞、安冬、李琰、康山進行文章的構思與設計、研究的實施與可行性分析、數據收集與整理、統計學處理、結果的分析與解釋、論文的撰寫、中/英文修訂；康山負責文章的質量控制及審校，對文章整體負責、監督管理。

本文無利益沖突。