乳腺癌組織中GSTP1和BRCA1及MGMT基因甲基化狀態(tài)及其與臨床病理特征的關(guān)系研究

錢小英，林海鋒，周安喜，卓曼云

乳腺癌患者數(shù)量在全球范圍內(nèi)呈不斷上升趨勢，已成為臨床重大難題之一［1］，其多發(fā)生于乳腺上皮組織，是一類惡性腫瘤。近年來，輔助診斷乳腺癌的啟動(dòng)子甲基化逐漸成為生物化學(xué)及醫(yī)學(xué)界的研究重點(diǎn)和熱點(diǎn)［2］。研究表明，多個(gè)癌基因及CpG位點(diǎn)的聯(lián)合檢測比單個(gè)癌基因更有利于診斷乳腺癌和揭示乳腺癌的臨床分型和分子病理機(jī)制［3］。同時(shí)許多維持機(jī)體正常活動(dòng)的DNA可能因乳腺癌啟動(dòng)子區(qū)CpG位點(diǎn)的甲基化而喪失其功能［4］。為加深對乳腺癌演變機(jī)制的認(rèn)識，本研究將重點(diǎn)針對乳腺癌組織中胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶P1（GSTP1）、乳腺癌易感基因1（BRCA1）/O6-甲基鳥嘌呤-DNA-甲基轉(zhuǎn)移酶（MGMT）基因甲基化情況及其與臨床病理特征的關(guān)系進(jìn)行分析，以期為乳腺癌的發(fā)生發(fā)展以及臨床診治提供參考依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）＞18歲女性；（2）組織標(biāo)本經(jīng)過病理學(xué)檢測后確診為乳腺癌；（3）行乳腺癌切除術(shù)前接受放射治療、化學(xué)藥物治療等；（4）知情同意并自愿參與本研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）伴有嚴(yán)重心、肝、腎功能不全或合并有其他高危疾病；（2）有神經(jīng)系統(tǒng)疾病史、精神疾病史以及近期服用精神疾病藥物；（3）有凝血功能障礙或其他手術(shù)禁忌證；（4）臨床資料不全。

1.2 研究對象 選取2015年1月—2016年6月海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院收治的符合納入標(biāo)準(zhǔn)的乳腺癌患者100例為研究對象，年齡為24～75歲，平均年齡（43.6±9.8）歲。本研究獲得本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3 研究方法 乳腺癌切除術(shù)中取患者乳腺癌組織及其邊緣5 cm處癌旁組織，分析患者乳腺癌組織臨床病理特征，并立即放入溫度為-196 ℃的液氮速凍箱中保存。

1.3.1 DNA的提取及亞硫酸處理 通過組織DNA提取試劑盒（德國Qiagen公司）對患者乳腺癌組織中GSTP1、BRCA1、MGMT基因DNA進(jìn)行提取，然后通過EZ DNA甲基化試劑盒-Gold（北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司，型號BTT3-D5024）對200～500 ng DNA進(jìn)行亞硫酸處理。試驗(yàn)操作均按照試劑盒說明書進(jìn)行規(guī)范操作，操作過程保證無污染。

1.3.2 甲基化特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）和電泳分析 加入1.5 μl經(jīng)亞硫酸鹽修飾的DNA模板、1.5 μl 10×緩沖液（含Mg2+）、0.12 μl Hotstar Taq DNA聚合酶、0.15 μl 20 nmol/L的下游引物、0.15 μl 20 nmol/L的上游引物、0.45 μl 20 mmol/L的dNTPs，混合調(diào)整后體積為15 μl，進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，取PCR產(chǎn)物5 μl進(jìn)行凝膠電泳。以經(jīng)過甲基化處理的DNA作為陽性對照，以未經(jīng)過甲基化處理的外周血淋巴細(xì)胞DNA（全基因組擴(kuò)增）作為陰性對照。GSTP1、BRCA1、MGMT基因甲基化特異性PCR擴(kuò)增基因的引物序列見表1。

表1 GSTP1、BRCA1、MGMT基因甲基化特異性PCR所用引物序列及反應(yīng)條件Table 1 The primer sequence and reaction conditions of methylationspecific PCR analysis of GSTP1，BRCA1 and MGMT genes

1.4 隨訪 自患者手術(shù)日起開始隨訪，截止時(shí)間為2017年11月，每3個(gè)月進(jìn)行電話隨訪，終點(diǎn)事件為死亡或失訪。記錄患者的生存情況、疾病進(jìn)展情況（局部復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、陽性淋巴結(jié)等）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 通過SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以（±s）表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；采用Cox回歸分析分析GSTP1、BRCA1、MGMT基因甲基化狀態(tài)與乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌組織及其邊緣5 cm處癌旁組織中GSTP1、BRCA1、MGMT基因甲基化情況 乳腺癌組織中GSTP1、BRCA1、MGMT基因甲基化特異性PCR的代表性結(jié)果見圖1。在100例乳腺癌組織中，GSTP1基因甲基化的發(fā)生率為31.0%（31/100），BRCA1基因甲基化的發(fā)生率為26.0%（26/100），MGMT基因甲基化的發(fā)生率為20.0%（20/100）；在乳腺癌組織邊緣5 cm處癌旁組織中，GSTP1基因甲基化的發(fā)生率為12.0%（12/100），BRCA1基因甲基化的發(fā)生率為8.0%（8/100），MGMT基因甲基化的發(fā)生率為4.0%（4/100）。乳腺癌組織邊緣5 cm處癌旁組織中GSTP1、BRCA1、MGMT基因甲基化的發(fā)生率低于乳腺癌組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=11.481、12.121、10.695，P值均＜0.001）。

在100例乳腺癌組織中，GSTP1、BRCA1、MGMT基因中至少1個(gè)基因發(fā)生甲基化54例（54.0%），其中3個(gè)基因均發(fā)生甲基化5例（9.3%）、任意2個(gè)基因發(fā)生甲基化18例（33.3%）、僅有1個(gè)基因發(fā)生甲基化31例（57.4%）。在100例乳腺癌組織邊緣5 cm處癌旁組織中，GSTP1、BRCA1和MGMT基因中至少1個(gè)基因發(fā)生甲基化21例（21.0%），其中3個(gè)基因均發(fā)生甲基化0例、任意2個(gè)基因發(fā)生甲基化5例（23.8%）、僅有1個(gè)基因發(fā)生甲基化16例（76.2%）。每例患者乳腺癌組織甲基化基因數(shù)為（0.74±0.09），低于乳腺癌組織邊緣5 cm處癌旁組織甲基化基因數(shù)（0.25±0.03），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=51.650，P＜0.001）。

圖1 3種基因在乳腺癌組織中甲基化特異性PCR代表性結(jié)果Figure 1 Representative results of PCR analysis of the methylation status of 3 genes in breast cancer tissues

2.2 GSTP1、BRCA1、MGMT基因甲基化與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系 不同腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況乳腺癌組織中甲基化基因數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。不同病理類型、人表皮生長因子受體2（HER-2）狀態(tài)、孕激素受體狀態(tài)乳腺癌組織中GSTP1、BRCA1、MGMT基因甲基化陽性率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；癌組織直徑≥20 mm、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移乳腺癌組織中GSTP1基因甲基化陽性率高于癌組織直徑＜20 mm、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移乳腺癌組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；年齡＜50歲、雌激素受體陰性乳腺癌組織BRCA1基因甲基化陽性率高于年齡≥50歲、雌激素受體陽性乳腺癌組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；組織學(xué)Ⅲ級、乳腺癌Ⅱ～Ⅳ期、淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移乳腺癌組織MGMT基因甲基化陽性率高于組織學(xué)Ⅰ～Ⅱ級、乳腺癌Ⅰ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移乳腺癌組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見表2）。

2.3 預(yù)后情況 100例患者中，治愈73例，疾病進(jìn)展27例，無死亡病例發(fā)生。

2.4 乳腺癌患者預(yù)后影響因素的Cox回歸分析 以預(yù)后為因變量（賦值：治愈=0，疾病進(jìn)展=1），以GSTP1基因甲基化陽性（賦值：是=0，否=1）、BRCA1基因甲基化陽性（賦值：是=0，否=1）、MGMT基因甲基化陽性（賦值：是=0，否=1）為自變量，進(jìn)行Cox回歸分析，結(jié)果顯示，GSTP1、BRCA1、MGMT基因甲基化陽性是乳腺癌患者預(yù)后的影響因素（P＜0.05，見表3）。

表3 乳腺癌患者預(yù)后影響因素的Cox回歸分析Table 3 Cox regression analysis of the prognostic factors in patients with breast cancer

3 討論

乳腺癌發(fā)生進(jìn)展的整個(gè)過程中，抑癌基因的失活和原癌基因的激活起著關(guān)鍵作用，同時(shí)也有其他多個(gè)基因表達(dá)參與［5-7］。目前認(rèn)為，基因啟動(dòng)子區(qū)的CpG位點(diǎn)的異常甲基化是乳腺癌發(fā)展過程中抑癌基因失活的主要原因［8］。因此CpG位點(diǎn)的異常甲基化逐漸成為乳腺癌臨床研究的熱點(diǎn)。但既往研究主要為單基因分析，故而研究結(jié)果不一致。目前已知一些重要基因會(huì)因啟動(dòng)子區(qū)的CpG位點(diǎn)的異常甲基化而失去其原有功能從而導(dǎo)致細(xì)胞癌變，如介導(dǎo)激素和受體、轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞信號、調(diào)控細(xì)胞周期、執(zhí)行DNA修復(fù)和細(xì)胞黏附等功能基因［9］。既往報(bào)道指出，基因異常甲基化的研究有利于診斷、治療乳腺癌及其病因探討［10］。因此進(jìn)一步探討乳腺癌相關(guān)基因與其演變過程及惡性特征的關(guān)系，可以幫助臨床及早診斷、治療乳腺癌。本研究結(jié)果顯示，乳腺癌組織中GSTP1、BRCA1、MGMT基因甲基化的發(fā)生率分別為31.0%、26.0%、20.0%。乳腺癌組織中GSTP1、BRCA1、MGMT基因甲基化的發(fā)生率高于乳腺癌組織邊緣5 cm處癌旁組織。有54.0%乳腺癌組織至少有1個(gè)基因發(fā)生甲基化。每例患者乳腺癌組織甲基化基因數(shù)高于乳腺癌組織邊緣5 cm處癌旁組織。

表2 GSTP1、BRCA1、MGMT基因甲基化與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系〔n（%）〕Table 2 Relationship of the methylation status in the promoter regions of GSTP1，BRCA1 and MGMT genes with the pathological features of breast cancer

研究顯示，GSTP1、BRCA1、MGMT基因的功能均是執(zhí)行DNA修復(fù)［11］。本研究通過聯(lián)合分析GSTP1、BRCA1、MGMT基因甲基化發(fā)現(xiàn)，不同腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況乳腺癌組織中甲基化基因數(shù)比較有差異。吳亮等［12］的研究亦指出，94.3%的乳腺癌患者至少有1個(gè)基因發(fā)生甲基化，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者BRCA1基因甲基化陽性率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，本研究結(jié)果與其相似。年齡＜50歲、雌激素受體陰性乳腺癌組織BRCA1基因甲基化陽性率高于年齡≥50歲、雌激素受體陽性乳腺癌組織，提示BRCA1基因甲基化與雌激素通路可能存在一定的相互作用關(guān)系。

本研究結(jié)果顯示不同病理類型、HER-2狀態(tài)、孕激素受體狀態(tài)乳腺癌組織的GSTP1、BRCA1、MGMT基因甲基化陽性率比較有差異。GSTP1通過參與機(jī)體代謝消除人體內(nèi)的有毒物質(zhì)從而發(fā)揮解毒、抗DNA損傷和抑制細(xì)胞癌變的作用［13］。而GSTP1基因啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化會(huì)使其無法表達(dá)，因此當(dāng)該基因發(fā)生甲基化時(shí)提示該乳腺癌患者預(yù)后不良［14］。現(xiàn)代分子生物學(xué)研究表明，MGMT基因的正常表達(dá)能夠修復(fù)細(xì)胞的烷化損害，維持DNA的穩(wěn)定［15］。當(dāng)該基因表達(dá)沉默時(shí)，機(jī)體DNA的轉(zhuǎn)錄、翻譯過程中會(huì)發(fā)生各種錯(cuò)誤并不斷積累直至基因紊亂、崩潰，使得原癌基因及其相關(guān)基因活化，產(chǎn)生癌細(xì)胞并迅速增殖［16-17］。因此當(dāng)MGMT基因發(fā)生甲基化而無法表達(dá)時(shí)，乳腺癌患者的疾病會(huì)迅速惡化，在乳腺癌分期上表現(xiàn)為較晚分期，提示其能夠影響乳腺癌的進(jìn)展與演變［18］。本研究結(jié)果也表明組織學(xué)Ⅲ級、乳腺癌Ⅱ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移乳腺癌組織MGMT基因甲基化陽性率高于組織學(xué)Ⅰ～Ⅱ級、乳腺癌Ⅰ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移乳腺癌組織。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，GSTP1、BRCA1、MGMT基因甲基化陽性是乳腺癌患者預(yù)后的影響因素。因此，GSTP1、BRCA1、MGMT基因發(fā)生異常甲基化時(shí)對評估乳腺癌患者預(yù)后有一定臨床價(jià)值。但本研究隨訪時(shí)間較短，未觀察到患者總生存期和無病生存期。在以后的研究中，可擴(kuò)大樣本量并延長隨訪時(shí)間以進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，GSTP1、BRCA1、MGMT基因能幫助修復(fù)DNA，發(fā)生甲基化基因數(shù)高于癌旁組織，且其發(fā)生異常甲基化時(shí)影響乳腺癌病情進(jìn)展。因此對其進(jìn)行聯(lián)合檢測甲基化有利于臨床診斷、治療乳腺癌并預(yù)測其預(yù)后。

作者貢獻(xiàn)：錢小英進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)施、資料收集與整理，撰寫論文并對文章負(fù)責(zé)；周安喜、卓曼云進(jìn)行試驗(yàn)實(shí)施、評估、資料收集；林海鋒進(jìn)行質(zhì)量控制及審校。

本文無利益沖突。