過表達GATA-4小鼠骨髓間充質干細胞通過分泌外泌體增強其抗凋亡能力的研究

賀繼剛，李貝貝，韓金秀，李洪榮，撒亞蓮，嚴丹，楊曉華*

冠心病引起的心肌梗死（即心肌損傷）已成為目前世界范圍內的頭號“殺手”。據世界衛生組織（WHO）統計：2000—2012年冠心病位居世界人口死亡原因首位［1-2］。目前冠心病的治療主要包括外科治療、內科治療及細胞治療。細胞治療中應用最為成熟的是骨髓間充質干細胞（BMSCs），雖然已有大量文獻證實BMSCs可以改善心肌梗死患者心功能［3］。但亦有學者提出，BMSCs臨床應用尚不成熟，主要表現為：（1）BMSCs安全性仍不確切；（2）目前為止國際、國內尚無文獻報道BMSCs能夠有效分化成為心肌細胞；（3）異體BMSCs治療心肌梗死依然遙遠。前期研究證實過表達GATA-4 BMSCs可以更為有效地增強BMSCs的抗凋亡能力從而修復受損心肌［4］。在前期研究基礎上［4］，本研究進一步聚焦于細胞分泌外泌體（Exosome），其具有多種生物學功能，可以使細胞在不需要直接接觸下完成細胞間生物信號轉導。

本研究提取慢病毒攜帶GATA-4轉染小鼠BMSCs分泌的Exosome，通過采用體外流式細胞術、Western blotting法檢測Exosome對心肌細胞的保護作用；給予心肌梗死模型小鼠干預措施后提高其心功能并行心肌梗死局部脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法（Tunnel）檢驗，表明過表達GATA-4 BMSCs分泌的Exosome可以通過增強BMSCs抗凋亡能力，有效改善心肌梗死后小鼠的心功能，現報道如下。

本研究創新點：

（1）本課題根據國內外關于GATA-4、外泌體（Exosome）及骨髓間充質干細胞（BMSCs）修復心肌梗死后損傷心肌結果的提示，結合本課題組的前期研究結果提出科學問題及假說。（2）近幾年國內外學者的研究側重點為BMSCs修復心肌梗死后損傷心肌的作用及細胞中的GATA-4獨立發生的作用，而關于BMSCs、GATA-4及Exosome與心肌損傷修復的研究鮮有報道。本研究首次明確過表達GATA-4 BMSCs分泌的Exosome在改善心功能中起重要作用。（3）本研究從細胞系、原代細胞、組織和動物整體水平等多方面進行實驗設計，挖掘Exosome、GATA-4及BMSCs三者間的關系，探索Exosome修復心肌損傷可能的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 2017年1—12月選取健康4周齡SPF級C57BL/6小鼠45只，均為雄性，由成都達碩實驗動物中心提供，動物許可證號為SCXK（川）2015—030。小鼠的喂養、觀察均按照非臨床研究管理規范（GLP）規定執行［4］。30只小鼠用于體外提取細胞共培養實驗，12只用于體內實驗構建心肌梗死模型，其余3只不做任何處理。

1.2 主要試劑和儀器 C57BL/6小鼠BMSCs培養基（低糖培養基，含10%胎牛血清）購自美國Cyagen Biosciences公 司。Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V Alexa Fluor?488 & PI- for Flow Cytometry 購 自 美 國Invitrogen 公司。CASPASE3、CASPASE9、CASPASE8、Cytochrome C購自美國CST公司。Tunnel試劑盒購自美國Roche公司。CD29、CD44、CD11b、干細胞抗原1（SCA-1）抗體購自美國BioLegend公司。CD11b Micro Beads購自美國Miltenyi公司。ExoQuick-TC、Exosome Antibodies、Array & ELISA Kits均購自美國SBI公司。小鼠心肌細胞購自賽齊（上海）生物工程有限公司。PHILIPS EPIQ 7C心臟超聲儀購自美國PHILIPS公司。

1.3 小鼠BMSCs的培養及鑒定 采用全骨髓培養法培養小鼠BMSCs，胰酶消化傳代至第3代時采用CD11b的磁珠負選，去除造血干祖細胞。取生長第8代BMSCs，待細胞融合達80%～90%時，制備單細胞懸液，采用流式細胞術檢測CD29、CD11b、CD44、SCA-1（PE-CD29 單抗 5 μl以 1∶20 稀釋至 100 μl、PE-CD11b 單抗 5 μl以 1∶40 稀釋至 100 μl、PE/Cy5-CD44 5μl以 1∶20稀 釋 至 100 μl、FITC anti-mouse SCA-1 5 μl以 1∶20 稀釋至 100 μl）。

1.4 GATA-4表達豐度的檢測 采用慢病毒載體及基因開啟技術構建過表達GATA-4 BMSCs，將GATA-4基因插入慢病毒包裝質粒GV308中，構建GV308-GATA-4重組慢病毒包裝質粒。然后將GV308-GATA-4重組慢病毒包裝質粒轉染入小鼠BMSCs并加入基因開啟劑強力霉素（DOX）。轉染成功后采用RT-PCR法檢測轉染48 h GATA-4表達豐度。

1.5 Exosome提取及檢測 按照ExoQuick-TC說明書提取Exosome，利用Exosome Antibodies、Array & ELISA Kits試劑盒檢測Exosome中CD9表達量并計算純度，繪制OD450處吸光度相關-回歸曲線并建立回歸方程，采用電鏡觀察Exosome形態。

1.6 體外實驗 分組情況：與過表達GATA-4 BMSCs分泌的Exosome共同培養的心肌細胞為A組（體外），與空載體BMSCs分泌的Exosome共同培養的心肌細胞為B組（體外），與BMSCs分泌的Exosome共同培養的心肌細胞為C組（體外），低氧（1%）無血清條件下培養的心肌細胞為D組（體外），正常條件下單獨培養的心肌細胞為E組（體外）。各組均培養48 h，后采用流式細胞術檢測各組心肌細胞凋亡率（按Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V Alexa Fluor?488 & PI-for Flow Cytometry說明書完成流式細胞術檢測）。采用Western blotting法檢測各組細胞相應時間點Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、細胞色素C表達水平。實驗獨立重復3次。

1.7 體內實驗

1.7.1 小鼠心肌梗死模型的制備 選取30只小鼠建立心肌梗死模型。直視下氣管插管并與小動物呼吸機連接，由第3肋間進入小鼠胸腔，以肺動脈圓錐與左心耳右緣之間交點和心尖的假想連線作為小鼠冠狀動脈前降支走行標志，以9-0縫線于左心耳根部下方進行縫扎，縫扎方向和左心耳下緣平行。結扎成功標志為左心室前壁及心尖周圍心肌組織運動減弱，心電圖出現明顯的S-T段抬高、aVF導聯見S-T段抬高超過0.2 mV。最后縫合肋骨，關閉肋間隙。

1.7.2 檢測過表達GATA-4小鼠BMSC分泌的Exosome通過抗凋亡作用修復心肌損傷的效果 采用ExoQuick TC法提取過表達GATA-4 BMSCs、空載體BMSCs、BMSCs分泌的Exosome。小鼠心肌梗死模型建模后48 h注射80 000 μg的Exosome，分組情況（每組3只小鼠）：A組（體內）注射過表達GATA-4 BMSCs分泌的Exosome；B組（體內）注射空載體BMSCs分泌的Exosome；C組（體內）注射BMSCs分泌的Exosome；另取3只心肌梗死未處理小鼠作為D組（體內）、3只正常小鼠作為E組（體內）。于注射Exosome后48 h采用心臟超聲儀評估各組小鼠心功能。完成心臟彩超后采用原位免疫組化法評估心肌梗死小鼠心臟凋亡細胞數量。

1.8 統計學方法 采用SPSS 15.0統計軟件進行數據分析。計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Bonferroni post-hoc檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 小鼠BMSCs鑒定結果 超過90%的小鼠BMSCs表達CD29（表達率為98.0%）、CD44（表達率為100.0%）和SCA-1（表達率為99.5%），但很少細胞表達CD11b（表達率為0.1%）。

2.2 GATA-4表達豐度 過表達GATA-4 BMSCs的GATA-4表達豐度為未過表達GATA-4 BMSCs的97.269倍，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.3 BMSCs分泌的Exosome提取及檢測結果 繪制OD450處吸光度相關-回歸曲線（見圖1）。回歸方程y=0.014 3x+0.197 4，小鼠BMSCs分泌的Exosome 表達量為0.272 5，Exosome純度為5.25×108個。Exosome大小40～100 nm，顆粒成團聚集（見圖2）。

2.4 體外實驗心肌細胞凋亡率 體外實驗5組心肌細胞凋亡率比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。A組（體外）細胞凋亡率低于B組（體外）、C組（體外）、D組（體外），高于E組（體外），差異有統計學意義（P＜0.05，見表1）。

2.5 體外實驗5組Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、細胞色素C表達水平比較 體外實驗5組Caspase-3、Caspase-9表達水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；體外實驗5組Caspase-8、細胞色素C表達水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。A組（體外）Caspase 8、細胞色素C表達水平低于B組（體外）、C組（體外）、D組（體外）及E組（體外），差異有統計學意義（P＜0.05，見表2、圖3）。

2.6 小鼠心肌梗死模型心電圖 小鼠心肌梗死模型心電圖示aVF導聯S-T段明顯抬高，幅度＞0.2 mV，提示心肌梗死模型建立成功。開胸后結扎前，記錄aVF導聯心電圖；結扎后再次記錄aVF導聯心電圖可見aVF導聯S-T明顯抬高，幅度超過0.2 mV（見圖4）。

圖1 相關-回歸曲線Figure 1 Correlation regression curve

圖2 Exosome形態Figure 2 Exosome form

表1 體外實驗5組心肌細胞凋亡率比較（n=3，x±s，%）Table 1 Proportion of apoptotic cells in myocardial infarction focus after intervention and adoption for 48 h among 5 groups in vitro

2.7 體內實驗5組小鼠心功能比較 體內實驗5組小鼠射血分數（EF）、環比收縮（FS）前后差值比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；5組小鼠環比舒張直徑（LVIDd）、環比收縮直徑（LVIDs）前后差值比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。A組（體內）小鼠EF、FS前后差值高于B組（體內）、C組（體內）、D組（體內）及E組（體內），差異有統計學意義（P＜0.05，見表3）。

2.8 體內實驗5組小鼠心肌細胞凋亡數量比較 鏡下可見A組（體內）的褐色凋亡細胞較B組（體內）及C組（體內）少，但較E組（體內）多（見圖5）。體內實驗5組小鼠心肌細胞凋亡數量比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。A組（體內）小鼠心肌細胞凋亡細胞數量高于E組（體內），而低于B組（體內）、C組（體內）、D組（體內），差異有統計學意義（P＜0.05，見表4）。

表2 體外實驗5組Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、細胞色素C表達水平比較（n=3,±s）Table 2 Comparison of expression levels of caspase-3，caspase-8，caspase-9，and cytochrome C among 5 groups in vitro

表2 體外實驗5組Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、細胞色素C表達水平比較（n=3,±s）Table 2 Comparison of expression levels of caspase-3，caspase-8，caspase-9，and cytochrome C among 5 groups in vitro

注：與A組（體外）比較，aP＜0.05

組別 Caspase-3 Caspase-8 Caspase-9 細胞色素C A組（體外） 1.03±0.21 0.37±0.13 1.18±0.08 0.41±0.21 B組（體外） 1.16±0.25 0.73±0.09a 1.19±0.02 0.73±0.06a C組（體外） 1.11±0.19 0.97±0.11a 1.19±0.07 0.75±0.17a D組（體外） 1.14±0.21 0.90±0.08a 1.08±0.13 0.71±0.10a E組（體外） 1.25±0.23 0.77±0.06a 1.06±0.19 0.80±0.06a F值 0.717 3.743 0.927 5.524 P值 0.805 ＜0.001 0.446 0.034

圖3 體外實驗Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、細胞色素C表達水平Figure 3 Expression levels of Caspase-3，Caspase-8，Caspase-9，and cytochrome C among 5 groups in vitro

表3 體內實驗5組小鼠心功能比較（n=3,x±s）Table 3 Comparison of the cardiac functions among 5 groups of mice in vivo

3 討論

圖4 小鼠心肌梗死模型建模前后aVF導聯心電圖Figure 4 aVF lead electrocardiogram before and after the establishment of mouse myocardial infarction model

治療冠心病引起的心肌梗死占用了大量醫療資源。目前BMSCs治療冠心病引起的心肌細胞損傷成為研究熱點。但多年來BMSCs發展卻相對滯后，主要原因是BMSCs的臨床應用安全性一直存在爭議。前期研究發現過表達GATA-4 BMSCs可以通過增強干細胞的抗凋亡能力改善心肌梗死后的心功能［4］。GATA結合蛋白是具有Ⅳ型鋅指結構的轉錄因子。有證據表明GATA-4在心肌肥大期間抑制成體心肌細胞凋亡過程中具有重要作用［4］，當細胞發生凋亡時GATA-4表達下降［5］。表明細胞的凋亡可以通過恢復GATA-4的作用而被減弱，GATA-4可以調節成體心臟細胞的存活。

本研究正是在前期研究基礎上［4］，將目光聚焦于BMSCs分泌的Exosome。Exosome是小的膜性囊泡，從20世紀90年代起受到極大關注［6-8］。此詞于1981年首先提出，是指從細胞上產生的鱗片狀脫落的囊泡，具有胞外酶的活性［7］。Exosome可能扮演細胞與細胞之間的信號作用，其可以遠距離運輸并將所攜帶物質釋放入細胞影響受體細胞的處理過程。如RNA從一個細胞穿梭到另一個細胞，被稱為“exosomal載體RNA”，能夠影響受體細胞的蛋白質產生［9-10］。

表4 體內實驗5組小鼠心肌細胞凋亡數量比較（n=3，x± s，個/高倍鏡）Table 4 Comparison of the number of cardiomyocytes apoptosis in 5 groups of mice in vivo

圖 5 心肌梗死局部凋亡細胞（原位免疫組化法，×40）Figure 5 Apoptotic cells in myocardial infarction focus after intervention and adoption for 48 h in 5 groups

本研究提出通過提取過表達GATA-4 BMSCs分泌的Exosome是否也可以通過增強干細胞抗凋亡能力進而改善心肌梗死后小鼠的心功能。

目前認為影響細胞凋亡的途徑主要有兩條：（1）通過以 Caspase-8 活化為代表的死亡受體通路，如Fas通路。（2）細胞色素C釋放及Caspase-9活化為代表的線粒體信號通路［11-12］。如果過表達GATA-4 BMSCs分泌的Exosome具有增強抗凋亡能力，其是通過哪條途徑改善了細胞的凋亡情況，目前尚不清楚。而據DENG等［13］報道過表達GATA-4 BMSCs可以顯著降低心肌細胞凋亡率，改善心肌梗死后心功能。本研究首次對其是否通過Exosome完成上述功能進行了證實。

本研究結果顯示：A組（體外）Caspase 8、細胞色素C表達水平低于B組（體外）、C組（體外）、D組（體外）及E組（體外）；A組（體內）小鼠心肌細胞凋亡數量高于E組（體內），而低于B組（體內）、C組（體內）、D組（體內）。初步證明過表達GATA-4 BMSCs分泌的Exosome可能是通過抑制細胞色素C釋放為代表的線粒體信號通路和Fas通路改善細胞凋亡情況。

本實驗為了進一步證實體外實驗結果，在小鼠心肌梗死模型造模48 h后，經尾靜脈注射過表達GATA-4-BMSCs分泌的Exosome、空載體-BMSCs分泌的Exosome、BMSCs分泌的Exosome，將不給予任何處理的心肌梗死模型小鼠及正常喂養的小鼠作為對照組。檢測給予干預措施48 h后的心功能改善情況，結果顯示：A組（體內）小鼠EF、FS前后差值高于B組（體內）、C組（體內）、D組（體內）及E組（體內）；A組（體內）小鼠心肌細胞凋亡細胞數量高于E組（體內），而低于B組（體內）、C組（體內）、D組（體內）。

綜上所述，過表達GATA-4 BMSCs分泌的Exosome可以通過增強心肌細胞的抗凋亡能力，有效改善心肌梗死后小鼠的心功能。

作者貢獻：賀繼剛、楊曉華進行文章的構思與設計；賀繼剛、李貝貝、韓金秀進行文章的可行性分析；李洪榮進行文獻/資料收集、整理；賀繼剛、楊曉華撰寫論文；撒亞蓮、嚴丹進行論文的修訂，英文的修訂；賀繼剛負責文章的質量控制及審校；賀繼剛、楊曉華對文章整體負責，監督管理。

本文無利益沖突。