牛支原等溫?cái)U(kuò)增凍干試劑盒研究

江敏，陳偉

摘 要：目的：針對(duì)牛支原體相關(guān)疾病的主要特點(diǎn)，對(duì)有效的治療藥劑進(jìn)行研究，通過藥劑制備實(shí)驗(yàn)，找出最為便捷敏感的診斷試劑。方法：根據(jù)已有的牛支原體疾病行管研究文獻(xiàn)，構(gòu)建相關(guān)細(xì)胞模型，制備濃度符合要求的實(shí)驗(yàn)溶液，將其當(dāng)做實(shí)驗(yàn)對(duì)照品應(yīng)用，并顯色溶液以及凍干品型溶解溶液準(zhǔn)備好，對(duì)多種不同的凍干試劑進(jìn)行組合實(shí)驗(yàn)應(yīng)用。設(shè)置等溫增擴(kuò)實(shí)驗(yàn)條件，設(shè)計(jì)多種保護(hù)劑組方，將相應(yīng)的干燥時(shí)間充分優(yōu)化，確保每一次干燥時(shí)間都保持高度精準(zhǔn)，對(duì)試劑盒的主要特異性進(jìn)行考察，同時(shí)對(duì)其穩(wěn)定性進(jìn)行了解。結(jié)果：在本次關(guān)于凍干型試劑盒的研究實(shí)驗(yàn)中，對(duì)8種不同的符合條件的保護(hù)劑進(jìn)行了研究，對(duì)基本的擴(kuò)增情況進(jìn)行了考察，最終發(fā)現(xiàn)部分保護(hù)劑并不會(huì)給等溫?cái)U(kuò)增現(xiàn)象帶去影響，一次干燥現(xiàn)象的基本升溫時(shí)間為3小時(shí)，相對(duì)地干燥時(shí)間為6小時(shí)，二次干燥工作消耗了4小時(shí)。結(jié)論：本文探討的這種凍干型試劑盒具有多種應(yīng)用優(yōu)勢(shì)，適合被應(yīng)用于牛疾病監(jiān)測(cè)工作之中。

關(guān)鍵詞：牛支原體；等溫?cái)U(kuò)增；試劑盒

牛支原體是一種在牛養(yǎng)殖環(huán)節(jié)中極為常見的病原體，存在這種病原體的牛感染乳腺炎、牛肺病的幾率是比較大的。這種病原體分布范圍極為廣闊，我國的牛養(yǎng)殖工作也會(huì)受到這種病原體的影響，部分牛因存在牛支原體，而出現(xiàn)了嚴(yán)重的壞死性肺炎，導(dǎo)致牛的死亡率升高，一般出現(xiàn)牛大量死亡的情況，養(yǎng)殖者需承擔(dān)極為嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)性損失。因此為了消除牛支原體疾病帶來的影響，給牛提供的病情診斷工作就顯得尤為關(guān)鍵，一般情況下，獸醫(yī)會(huì)選擇應(yīng)用病原鑒定與分離技術(shù)來對(duì)牛存在的疾病進(jìn)行判斷，但是牛支原體存在生長速度相對(duì)緩慢的問題了，在對(duì)相應(yīng)的菌落情況進(jìn)行觀測(cè)時(shí)，需要消耗極多的時(shí)間，等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)比較適合被用于該種疾病檢測(cè)工作中，本文對(duì)開展等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)工作時(shí)需要應(yīng)用的凍干型試劑的相關(guān)情況進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 一般材料

牛支原體PG45株（ATCC）、牛支原體HB-1株、牛支原體SD-2株、牛鼻支原體（ATCC）和無乳支原體（ATCC），均接種于含有2.59酵母粉和20%馬血清的類胸膜肺炎微生物肉湯培養(yǎng)基（PPLO）中，在含有5%CO2的37℃溫箱中培養(yǎng)；多殺性巴氏桿菌931株（CVCC），接種于ISB培養(yǎng)基中，37℃條件下培養(yǎng)；牛結(jié)核桿菌菌液。

1.2 方法

凍干保護(hù)劑的初步篩選：選取常用的凍干疫苗耐熱保護(hù)劑如蔗糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇、甘氨酸、牛血清白蛋白、酪蛋白和水解乳蛋白，作為等溫?cái)U(kuò)增試劑的耐熱凍干保護(hù)劑原料。向等溫?cái)U(kuò)增試劑中分別加入上述保護(hù)劑；其中海藻糖的濃度為10%（質(zhì)量體積比，w/v），其他物質(zhì)的濃度均為5%（質(zhì)量體積比，w/v），以不添加任何保護(hù)劑的等溫?cái)U(kuò)增試劑作為對(duì)照。40℃冷凍4h后；置室溫溶解，加入濃度為104拷貝/μL的陽性對(duì)照品，恒溫儀中63℃反應(yīng)1h。反應(yīng)結(jié)束后，采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，并據(jù)此篩選對(duì)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)沒有影響的凍干保護(hù)劑。

等溫?cái)U(kuò)增試劑共晶點(diǎn)的測(cè)定：按最佳的凍干保護(hù)劑組方配制等溫?cái)U(kuò)增試劑，加至西林瓶中。再將共晶點(diǎn)測(cè)試探頭伸入西林瓶中的液面下，通過記錄軟件可以記錄等溫?cái)U(kuò)增試劑由液態(tài)變?yōu)楣虘B(tài)過程中電阻率的變化。等溫?cái)U(kuò)增試劑的溫度曲線和電阻率曲線的交叉點(diǎn)即為等溫?cái)U(kuò)增試劑的共晶點(diǎn)。

等溫?cái)U(kuò)增凍干試劑盒的組裝與使用方法：等溫?cái)U(kuò)增凍干試劑盒主要包括等溫?cái)U(kuò)增試劑凍干品、甜菜堿溶液、陽性對(duì)照品溶液和顯色液。用時(shí)將甜菜堿溶液加入等溫?cái)U(kuò)增混合物凍干品中溶解，加至PCR反應(yīng)管中，每管20μL。向各PCR管中加入樣品液或陽性對(duì)照品，同時(shí)用純凈水做陰性對(duì)照。

敏感性檢驗(yàn)：用天根質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒，通過微量分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)粒濃度，進(jìn)行10倍連續(xù)倍比稀釋，按100-105個(gè)拷貝濃度加至等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系中，用等溫?cái)U(kuò)增凍干試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物可通過顏色變化和瓊脂凝膠電泳方法進(jìn)行檢測(cè)。

特異性檢驗(yàn)：取牛支原體PG-45株、HB-1株以及SD-2株菌液，活菌計(jì)數(shù)后用無菌水稀釋至104CCU-mL-1。同時(shí)，取牛鼻支原體菌、無乳支原體菌液、多殺性巴氏桿菌、結(jié)核分枝桿菌，置水浴中煮沸10min后冷卻，同時(shí)用等溫?cái)U(kuò)增凍干試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，通過顏色變化或瓊脂凝膠電泳方法判斷陰陽性。

2 結(jié)果

凍干保護(hù)劑的初步篩選：保護(hù)劑的初步篩選結(jié)果表明，只有添加10%w/v海藻糖、5%w/v甘露醇或牛血清白蛋白的等溫?cái)U(kuò)增試劑能進(jìn)行正常的擴(kuò)增反應(yīng)，其它保護(hù)劑均會(huì)抑制擴(kuò)增反應(yīng)。

一次干燥時(shí)，由于干燥時(shí)間過長，導(dǎo)致制品表面形態(tài)較差，而干燥的升溫時(shí)間選擇2h和3h進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果表明，干燥時(shí)間為3h時(shí)，制品的水分含量過高，說明干燥溫時(shí)間為2h時(shí)，雖然制品的外觀性狀較好，但是升溫速度過快，通過時(shí)間過短。由此，選擇6h為一次干燥的干燥時(shí)間。

等溫?cái)U(kuò)增凍干試劑盒的敏感性檢測(cè)：以不同濃度梯度的質(zhì)粒P-uvrC為模板，利用等溫?cái)U(kuò)增凍干試劑盒檢測(cè)敏感性，顯色與凝膠電泳結(jié)果均表明，等溫?cái)U(kuò)增凍干試劑盒最低可檢測(cè)到10個(gè)拷貝的質(zhì)粒。

等溫?cái)U(kuò)增凍干試劑盒的特異性檢測(cè)：陰性對(duì)照顯褐色且無條帶，陽性對(duì)照顯綠色且有典型條帶，證明對(duì)照成立。牛支原體PG45株、HB-1株以及SD-2株經(jīng)等溫?cái)U(kuò)增凍干試劑盒檢測(cè)，均顯綠色和典型的梯形條帶，判定為陽性；牛鼻支原體、無乳支原體、多殺巴氏桿菌和結(jié)核桿菌經(jīng)試劑盒檢測(cè)，均顯褐色且無典型條帶，判定為陰性。

3 討論

針對(duì)牛支原體類疾病的基本檢測(cè)需要，相關(guān)人員提供了等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)，將檢測(cè)溫度調(diào)節(jié)為恒溫，檢測(cè)工作在1個(gè)小時(shí)之內(nèi)就能被完成，從集體的牛支原體檢測(cè)工作中，可以發(fā)現(xiàn)該種檢測(cè)方法具有比較高的靈敏度，同時(shí)還存在特異性優(yōu)勢(shì)，可以被應(yīng)用到多種病原檢測(cè)工作之中，該項(xiàng)檢測(cè)技術(shù)對(duì)于應(yīng)用者的技術(shù)水平限制比較寬松，因此在基層醫(yī)療領(lǐng)域之中也可被應(yīng)用。但是實(shí)際應(yīng)用問題也是存在的，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)的等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)系統(tǒng)后，其中的酶物質(zhì)比較容易出現(xiàn)降解的情況，檢測(cè)人員不能對(duì)檢測(cè)樣品進(jìn)行長期保存，在運(yùn)輸過程中樣品也會(huì)出現(xiàn)變化，在對(duì)牛支原體相應(yīng)的疫苗進(jìn)行制備時(shí)，一般會(huì)借用干燥冷凍技術(shù)來對(duì)便于儲(chǔ)存的凍干型疫苗加以制備，在處理等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)環(huán)節(jié)之中需要使用的各種試劑時(shí)，也可以選擇應(yīng)用這種凍干方法，在制備相應(yīng)的試劑盒時(shí)，同樣需要對(duì)穩(wěn)定性、特異性以及敏感性進(jìn)行考察，本文從這個(gè)角度展開研究，最終獲得了相對(duì)理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，凍干應(yīng)用效果比較理想。

冷凍干燥技術(shù)屬于一種可靠度比較高的通用方法，其在保持生物類型的制品的穩(wěn)定性方面有比較好的應(yīng)用效果，為了應(yīng)對(duì)具體的凍干應(yīng)用問題，相關(guān)的凍干技術(shù)還需被從多個(gè)角度加以改進(jìn)。

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