電針預(yù)處理對換籠失眠大鼠睡眠覺醒的影響*

謝 晨,李 璐,高曉林,趙 娜,楊文佳,陳云飛△

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院,上海 200437;2.上海市針灸經(jīng)絡(luò)研究所,上海 200030;3.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院,浙江 杭州 310005)

失眠是一種高流行的疾病,在工業(yè)化國家,大約有1/4的人一生中在一定程度上受到睡眠問題的干擾,10%～15%的人影響到了日間功能,6%～10%的人符合失眠的診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]。睡眠障礙疾病國際分類第3版(ICSD3)將失眠分為慢性失眠、急性失眠和其他類型的失眠。急性失眠與首次抑郁相關(guān),治療急性失眠對于防止抑郁的發(fā)生意義重大[2]。早期干預(yù)急性失眠對于失眠的慢性化及向其他疾病轉(zhuǎn)化意義重大。目前對于急性失眠的研究較少,換籠模型作為急性失眠模型的一種,能夠反應(yīng)急性失眠發(fā)生的原因。研究顯示多巴胺D2受體、組胺脫羧酶基因敲除的小鼠及Dbh -/-小鼠(缺乏合成去甲腎上腺素的功能)不表現(xiàn)換籠失眠[3]。給予表現(xiàn)為急性換籠失眠的小鼠多巴胺受體拮抗劑后,換籠小鼠的急性失眠能夠被改善[4]。本研究從應(yīng)激相關(guān)的激素和多巴胺及其受體角度探討電針干預(yù)急性失眠的部分機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

SPF級健康雄性SD大鼠160只,體質(zhì)量(300±20)g，給予標(biāo)準(zhǔn)飼料和高壓滅菌墊料飼養(yǎng)，均由上海市斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司動物提供，許可證號為SCXK(滬)2012-0002。大鼠飼養(yǎng)于實驗動物中心，許可證號為SYXK(滬)2013-0109。環(huán)境溫度為(24±1)℃、濕度為(60±2)%、隔音、靜電屏蔽、明暗周期為12 h，以7:00和19:00為分界點，光照度≈100 lux,大鼠可以自由飲食、活動,適應(yīng)性飼養(yǎng)1～4星期。

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3～5天后,稱重,單籠飼養(yǎng),將適合條件的大鼠按照體重采用SPSS統(tǒng)計軟件產(chǎn)生隨機數(shù)字，并隨機分為對照組、模型組、電針組和假電針組4組,每組分為換籠后0 min、30 min、2 h和6 h共4個時間點,每組每個時間點各8只。其中24只用于腦電監(jiān)測。

1.2 大鼠電極埋置術(shù)

采用10%水合氯醛(360 mg/kg,ip)進行麻醉,待大鼠四肢無力后剃除大鼠頭頸部體毛,將其固定于腦立體定位儀上,按文獻方法[5],在大鼠頭部植入腦電電極、頸部皮膚插入肌電波電極。具體步驟：75%乙醇或苯扎溴消毒手術(shù)區(qū),手術(shù)刀片切開顱頂皮膚,剝離皮下組織后刮除骨膜,暴露顱骨,參考大鼠腦立體定位圖譜,中線右側(cè)旁開2～3 mm,前囟前2 mm和前囟后2 mm兩個點以直徑為0.5 mm顱骨鉆鉆孔,至有透破感(鉆通顱骨,但未觸及腦組織)后停止,安裝記錄腦電電極螺絲;中線左側(cè)旁開2～3 mm,前囟前2 mm以相同鉆頭鉆孔,不鉆透顱骨,安裝參考電極螺絲;后囟前后取中線左右等距離的兩點以同樣鉆頭鉆孔,不鉆透顱骨,安裝固定電極螺絲,見圖1。將顱骨上的螺絲安裝好后,將用來記錄肌電的兩根銀絲直接插入頸部肌肉。將造牙粉與義齒基托樹脂凝膠Ⅱ型混合成糊狀放置于顱骨上,注意修正造牙粉凝固后形狀，并防止與顱骨骨膜黏連,待造牙粉凝固后縫合創(chuàng)口，給予青霉素腹腔注射預(yù)防感染。待動物蘇醒后移入專門的睡眠生物解析系統(tǒng)飼養(yǎng)籠內(nèi)恢復(fù),恢復(fù)1周后用于實驗記錄,予以標(biāo)準(zhǔn)飲食和光照。

圖1 大鼠腦電極、參比電極、固定螺絲安裝位置

1.3 模型制備

大鼠植入電極1周后或不值入電極的各組大鼠適用性飼養(yǎng)1周后，置于單獨的睡眠解析記錄籠中，單獨飼養(yǎng)4天后,于第5天10:00AM,將記錄籠中的大鼠與本組其他記錄籠中的大鼠互換記錄籠,如模型組的序號為1大鼠與序號為2的大鼠交換位置，序號為2 的大鼠與序號為3的大鼠交換位置，以此類推，制備換籠失眠大鼠模型[1]。

1.4 主要儀器

腦電記錄睡眠軟件(sleepsign,日本Kissei Comtec);睡眠生物解析系統(tǒng)(Biotex Kyoto,日本);腦立體定位儀(51600,美國toelting);電鉆(南韓世洋,Escort-Ⅲ);NeuroLog放大器(NL900D,日本Digitimer);臺式離心機(TDL-5-A,上海安亭科學(xué)儀器廠);電針治療儀(G6805-2,上海醫(yī)療器械高技術(shù)公司);酶標(biāo)儀(352型,芬蘭Labsystems Multiskan MS);恒溫烘箱(DHG-9023A ,上海恒一科學(xué)儀器有限公司);石蠟切片機(SQ2125,徠克公司);顯微照相系統(tǒng)(OLYMPUS-BX51,奧林巴斯光學(xué)工業(yè)株會社)等。

1.5 主要試劑

水合氯醛(20141011,國藥集團化學(xué)試劑有限公司);義齒基托樹脂凝膠Ⅱ型(140508,上海二醫(yī)張江生物材料有限公司);造牙粉(140316,上海二醫(yī)張江生物材料有限公司);0.9%氯化鈉注射液[H20003139,華裕(無錫)制藥有限公司];注射用青霉素鈉(H13020655,華北制藥股份有限公司);Elisa試劑盒(201512,Bioswamp);多巴胺D1受體(Ab40653,abcam);多巴胺D2受體(sc-5303,Santa cruz);廣譜二抗(D-3004,上海長島生物技術(shù)有限公司);DAB濃縮型試劑盒(FL-6001,上海長島生物技術(shù)有限公司);蘇木素(714094,BASO)等。

1.6 干預(yù)方法

假電針組：在穴位表皮給予鈍性刺激,不予接電針。

電針組：使用0.16 mm×13 mm一次性針灸針,將針刺入神門、三陰交(參考林文注編著的《實驗針灸學(xué)》,于每日9:00—10:00AM進行干預(yù),接G6805-2型電針儀,連續(xù)波,10 Hz,強度以小鼠腿部輕微振動為準(zhǔn),電壓2 V,電針15 min,電針的正負極分別接兩側(cè)神門穴及三陰交穴,每日1次,共3次。

電針組和假電針組于干預(yù)后10:00AM進行換籠。

1.7 取材

于換籠后0 min、30 min、2 h和6 h將各組大鼠麻醉后,打開腹腔,找到腹主動脈后取血。待血液凝固后離心取上清液,放于-80℃冰箱中長期保存。

腦電組大鼠腦電記錄結(jié)束后打開胸腔,暴露心臟,從心尖處插入針頭,剪開右心耳,注入PBS,待大鼠前肢及兩肺變白后,注入多聚甲醛,至大鼠頸部變硬。取腎上腺放置于多聚甲醛中,4℃保存。大腦放置于多聚甲醛中,隔夜換30%蔗糖,4℃長期保存。

1.8 觀察指標(biāo)

1.8.1 血清激素水平測定 采用ELISA法測定大鼠下丘腦及血清DA、NA、EPI、CRH、ACTH、CORT。將血清從-80℃冰箱中取出，水浴箱中融化。按照試劑盒說明書分步驟進行操作，最后測量得出OD值，進一步轉(zhuǎn)化為濃度。

1.8.2 腦電圖記錄及分析 大鼠腦電和肌點信號首先經(jīng)睡眠生物解析系統(tǒng)處理后,與SleepSign軟件(Kissei Comtec,Nagano,Japan)連接記錄腦電和肌電。記錄結(jié)束后,運用SleepSign分析軟件,將大鼠24 h的腦電和肌電以4 s為1個分析單元,按照統(tǒng)一設(shè)定的標(biāo)準(zhǔn)自動掃描并判別出覺醒(wake,W)、非快速動眼睡眠(NREMS)和快速動眼睡眠(rapid eye movement sleep,REMS)。并在自動掃描完成后,進行人工校正。

以晝夜24 h為橫坐標(biāo),以每個時間點每小時各時相的量為縱坐標(biāo),繪制時程曲線(time course)。時程曲線反映的是睡眠異常出現(xiàn)的時間。根據(jù)統(tǒng)計結(jié)果,標(biāo)記出組間有差異的點,計算晝夜12 h/12 h的累積量,做出直方圖;如數(shù)據(jù)點集中出現(xiàn)在某一區(qū)段,則計算這一區(qū)段的累積量,做出直方圖。累計直方圖反應(yīng)的是晝夜12 h/12 h或是某一時間段的睡眠變化。

1.8.3 HPA軸多巴胺受體的表達 將固定的組織取出，分離下丘腦、垂體和腎上腺，將組織進行脫水、透明、包埋等處理后，依次按照免疫組化步驟操作，最后用中性樹膠進行封片，烘干后在光學(xué)顯微鏡下觀察攝片。

1.9 統(tǒng)計方法

采用SPSS18.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。計量資料服從正態(tài)分布,采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,4組組間比較采用完全隨機設(shè)計資料方差分析,兩兩比較如果滿足方差齊性則采用LSD檢驗,如果方差不齊則采用Dunnett′s T3檢驗。兩因素四水平的數(shù)據(jù)資料采用析因設(shè)計資料的方差分析。計量資料不服從正態(tài)分布,用M(P25,P75)表示,采用 Kruskal-Wallis H 檢驗分析,組間兩兩比較采用 Mann-Whitney U檢驗。檢驗水準(zhǔn)為α=0.05。

2 實驗結(jié)果

2.1 電針對換籠失眠大鼠睡眠覺醒量的影響

2.1.1 換籠前4組大鼠睡眠覺醒量比較 干預(yù)前4組大鼠日間睡眠覺醒量、夜間睡眠覺醒量、總的睡眠覺醒量(圖2左側(cè)3圖)及各時間點的睡眠覺醒量(圖2右側(cè)3圖),差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.1.2 電針治療后4組大鼠睡眠覺醒量比較 電針減少換籠大鼠日間覺醒。模型組和假電針組表現(xiàn)為日間wake 時間延長(P<0.05,P<0.01),NREM 睡眠減少(P<0.05),同對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義;電針組同對照組相比,睡眠覺醒量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。換籠后1 h、2 h、7 h，模型組和假電針組表現(xiàn)為明顯的覺醒增加，NREM減少，同對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01);電針組同對照組相比,睡眠覺醒量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。模型組大鼠表現(xiàn)為夜間2 h覺醒增加、NREM睡眠減少，同對照組相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，隨后夜間6～11 h表現(xiàn)為覺醒增加、NREM睡眠減少的趨勢，9 h、11 h REM睡眠增加(P<0.05或P<0.01)。見圖3。

圖2 換籠前4組大鼠睡眠覺醒比較(n=7～8)

圖3 電針治療后4組大鼠睡眠覺醒比較注:與對照組比較,*P<0.05,**P<0.01

2.2 電針對換籠失眠大鼠各時點外周血清激素水平的影響

2.2.1 兩組大鼠各時點外周血清激素水平變化比較 2×4水平析因設(shè)計結(jié)果表明,對照組和模型組大鼠外周血激素水平比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),兩組各時間點外周血激素水平比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),換籠行為和時間交互作用比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),表明換籠行為對大鼠外周血6種激素水平無影響,大鼠各時間血清激素水平無差異。詳見表1。

2.2.2 3組大鼠各時點外周血清激素水平變化比較 3×4水平析因設(shè)計結(jié)果表明,電針各水平即模型組、假電針組和電針組大鼠組間比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),3組各時間點外周血激素水平比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),換籠行為和時間交互作用比較,外周血NA受到不同電針?biāo)胶蜁r間因素的影響(P<0.05),其余差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),表明電針不同水平對大鼠外周血6種激素水平無影響,大鼠各時間血清激素水平無差異。詳見表1。

2.3 4組HPA軸多巴胺受體變化比較

免疫組化陽性結(jié)果為可見棕褐色的沉積物,由于多巴胺受體為膜受體,因此,本次免疫組化的結(jié)果主要看細胞膜上的棕褐色沉積物,細胞核呈深藍色或者深棕色。經(jīng)過蘇木素對比染色,非陽性的細胞則被染成藍色。

2.3.1 4組下丘腦多巴胺受體變化比較 光學(xué)顯微鏡下可見：對照組大鼠下丘腦中有大量的細胞胞膜呈棕褐色細胞,見封三彩圖4a、5a;模型組大鼠下丘腦中胞膜呈棕褐色細胞數(shù)量減少,見封三彩圖4b、5b;電針后大鼠下丘腦中胞膜呈棕褐色細胞數(shù)量增加,見封三彩圖4c、5c;假電針組大鼠下丘腦中胞膜呈棕褐色細胞數(shù)量少量增加,見封三彩圖4d、5d。

2.3.2 4組垂體多巴胺受體變化比較 對照組大鼠垂體中有大量的細胞胞膜呈棕褐色細胞,見封三彩圖6a、7a;模型組大鼠垂體中胞膜呈棕褐色細胞數(shù)量減少,見封三彩圖6b、7b;電針干預(yù)后大鼠垂體中胞膜呈棕褐色細胞數(shù)量增加,見封三彩圖6c、7c;假電針組大鼠垂體中胞膜呈棕褐色細胞數(shù)量少量增加,見封三彩圖6d、7d。

2.3.3 4組腎上腺多巴胺受體變化比較 對照組大鼠腎上腺中有大量的細胞胞膜呈棕褐色細胞,見封三彩圖8a、9a;模型組大鼠腎上腺中胞膜呈棕褐色細胞數(shù)量減少,見封三彩圖8b、9b;電針及多巴胺受體拮抗劑干預(yù)后大鼠腎上腺中胞膜呈棕褐色細胞數(shù)量增加，見封三彩圖8c、9c;假電針組大鼠腎上腺中胞膜呈棕褐色細胞數(shù)量少量增加,見封三彩圖8d、9d。

表1 各組大鼠各時點外周血DA、EPI、NA、ACTH、CRH、CORT變化比較

3 討論

失眠,中醫(yī)學(xué)稱為不寐,在《內(nèi)經(jīng)》中稱為“不得臥”“目不瞑”，并提出了失眠的病機為“衛(wèi)氣不得入于陰,陰虛,故目不瞑”,治則為“補其不足,瀉其有余,調(diào)其虛實”。《類證治裁·不寐》指出:“陽氣自動而之靜,則寐;陰氣自靜而之動,則寤;不寐者,病在陽不交陰也。”指出不寐的病機為陽盛陰衰,陰陽失交。

慢性失眠應(yīng)用較多的穴位為神門、三陰交、百會和足三里等。明清時期治療失眠穴位中出現(xiàn)頻次較多的穴位依次是三陰交、神庭、大巨、膽俞、足竅陰、隱白、公孫和液門[6]。古代醫(yī)家針灸治療失眠多選取足太陽膀胱經(jīng)穴,下肢部穴居多,特定穴多用背俞穴,使用最多的穴位為神門、三陰交[7-8]。故本次選用神門、三陰交治療換籠失眠。神門為手少陰心經(jīng)原穴,具有寧心安神之功。三陰交為足三陰經(jīng)交會穴,具有調(diào)理肝、脾、腎之功,二穴合用,能夠調(diào)理心肝、脾、腎的功能而發(fā)揮治療失眠之功。

換籠失眠模型為一個生理社會應(yīng)激因子,作用于睡眠的神經(jīng)生物因子的模型,大鼠換籠后表現(xiàn)為睡眠潛伏期增加,NREM和REM睡眠下降,睡眠片段化增強,NREM中高頻率的腦電活動增加[9]。本次研究發(fā)現(xiàn),換籠后,同對照組大鼠相比,模型組和假電針組大鼠表現(xiàn)為日間覺醒,NREM量增多,提示日間睡眠減少(P<0.05),這與文獻報道相一致[9]。電針組和對照組大鼠相比,無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05),提示電針預(yù)處理能夠改善換籠失眠大鼠的睡眠覺醒。而各時點的睡眠覺醒量表示，大鼠在換籠后1 h、2 h、7 h覺醒增多，NREM睡眠減少，這與文獻研究的結(jié)果有差異，原因可能與大鼠睡眠覺醒監(jiān)測方法不同有關(guān)，文獻中大鼠睡眠覺醒是以12 s為1個單位進行監(jiān)測，而本次研究采用4 s為1個單位監(jiān)測。

急性失眠的病因理論3P模型認為,急性失眠與3個因素相關(guān),3個因素分別指的是傾向、誘發(fā)和維持,傾向是生物心理社會學(xué)的范疇,是個體的心理素質(zhì),誘發(fā)因素指威脅或應(yīng)激的生活事件,急性失眠與傾向和誘因相關(guān)[10],即急性失眠的發(fā)生與應(yīng)激因素相關(guān)。多巴胺系統(tǒng)與行為過度覺醒相關(guān)[11],而下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸(HPA軸)和藍斑-去甲腎上腺素能神經(jīng)元軸(LC-NE)與應(yīng)激相關(guān)[12],HPA軸分泌CORT、CRH、ACTH共3種激素,藍斑-去甲腎上腺素能神經(jīng)元軸則主要分泌EPI和NA,因此本次研究探討了電針對應(yīng)激軸的相關(guān)激素及多巴胺和HPA軸上多巴胺受體變化的影響。研究[9]認為大鼠在換籠后1～2 h表現(xiàn)為急性應(yīng)激狀態(tài)，隨后3～4 h大鼠在睡眠壓力的作用下睡眠覺醒無差異，而隨后4～6 h表現(xiàn)為急性失眠的狀態(tài)，小鼠的換籠行為顯示換籠后30 min、2 h外周血的皮質(zhì)醇均表現(xiàn)明顯的差異[4]，故本研究選用0 min、30 min、2 h和6 h共4個時間點檢測大鼠外周血激素的變化。0 min為換籠前，30 min為應(yīng)激最明顯時間，2 h為應(yīng)激結(jié)束，而6 h為急性失眠期。

2×4水平析因設(shè)計結(jié)果表明,模型制備與否對于大鼠外周血DA、EPI、NA、CORT、ACTH、CRH無影響,模型組與對照組各時間點外周血激素水平比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),造模與否和時間交互作用比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),表明模型對大鼠外周血6種激素水平無影響,大鼠各時間血清激素水平無差異。電針3個水平與時間4個水平的3×4水平析因設(shè)計結(jié)果表明電針的不同水平對于外周血激素水平無影響,各組不同時點的激素水平比較無差異,僅僅外周血NA受到不同電針?biāo)胶蜁r間因素的影響(P<0.05)。上述結(jié)果可能是由于換籠行為未影響到外周血的神經(jīng)遞質(zhì)或者急性應(yīng)激狀態(tài)下外周血的神經(jīng)遞質(zhì)被機體的其他因素影響而未出現(xiàn)變化。以往研究表明電針“神門”“三陰交”降低血漿NE、DA、EPI以及丘腦和腦干中NE、DA含量,抑制交感-腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)的過度興奮治療失眠[13],針刺或者電針能夠抑制下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA)的活性,降低慢性應(yīng)激焦慮大鼠血漿CORT含量[14]。電針降低慢性應(yīng)激模型大鼠垂體ACTH、腎上腺CORT的分泌,可能通過調(diào)整垂體ACTH和腎上腺CORT的過度分泌,進而糾正HPA軸亢進[15]。電針可顯著降低焦慮大鼠下丘腦室旁核CRH和CRHR1mRNA表達[16]。電針神門、三陰交降低心理應(yīng)激失眠大鼠其腦組織Ach、CRH和血漿ACTH、CORT進而調(diào)節(jié)失眠大鼠HPAA的興奮[17]。本次研究結(jié)果與之不同的主要原因為當(dāng)前研究選用慢性應(yīng)激焦慮大鼠模型,模型制作的方法不同,造模時間不同。

動物研究認為,多巴胺在覺醒和REM睡眠時增高,NREM時降低。多巴胺受體激動劑增加覺醒,拮抗劑增加睡眠。D1受體激動劑增加覺醒,減少REM睡眠[18];D2受體激動劑對睡眠覺醒的作用為雙向的,低劑量減少覺醒,增加NREM和REM睡眠,高劑量表現(xiàn)相反[19]。D1受體拮抗劑增加總的睡眠和REM睡眠是區(qū)別于其他多巴胺受體拮抗劑的一個特征[20]。D2受體拮抗劑總的增加睡眠,但也與劑量相關(guān)[21]。最新的研究表明,D2受體基因敲除的小鼠表現(xiàn)為夜間覺醒減少,NREM和REM增加[22],多巴胺轉(zhuǎn)運體蛋白基因敲除小鼠(DAT-KO mice)表現(xiàn)為一個新的覺醒狀態(tài)[23]。上述研究均表明,多巴胺受體與睡眠覺醒密切相關(guān)。本次研究發(fā)現(xiàn)換籠后24 h模型組大鼠HPA軸的D1和D2受體表達水平顯著降低,而電針干預(yù)后HPA軸的D1和D2受體表達水平升高。說明電針可能通過調(diào)節(jié)HPA軸D1和D2受體表達水平干預(yù)急性失眠。

本研究采用電針預(yù)處理換籠失眠大鼠,為臨床治療急性失眠提供實驗室依據(jù),探討電針干預(yù)換籠失眠的多巴胺及其受體機制,為研究急性失眠提供了一定的研究基礎(chǔ),便于電針治療急性失眠在臨床應(yīng)用。未來將從中樞DA、EPI、NA、CORT、ACTH、CRH水平及DA受體的蛋白和mRNA水平共同探討電針干預(yù)換床失眠的機制,同時給予多巴胺相關(guān)的激動劑和拮抗劑,深入探討電針的作用機制。