快速檢測金黃色葡萄球菌的一種氮源的酶解優(yōu)化策略

龍 婧， 李婷婷， 王全林， 田亞平*

(1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；2. 蘇州榮氏生物制品有限公司，江蘇 蘇州 215000)

牛肉浸粉作為氮源存在于多種培養(yǎng)基中培養(yǎng)各種微生物，所以可以根據(jù)不同的培養(yǎng)目的，選擇不同含有牛肉浸粉加入的培養(yǎng)基，如普通培養(yǎng)基、檢測培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基等[1]。這類氮源有兩種形式，其中膏狀物溶解性差、稱量困難且浪費(fèi)嚴(yán)重，而牛肉浸粉因溶解性好、方便使用得到較多應(yīng)用。國內(nèi)外的牛肉浸粉因原料和生產(chǎn)工藝的不同在質(zhì)量上差別比較大[2]。牛肉浸粉應(yīng)用面廣泛，對一種國產(chǎn)牛肉浸粉通過酶解法優(yōu)化改善其多肽和氨基酸的成分及比例，并通過幾種典型細(xì)菌生長培養(yǎng)的比較，找出其中的一些規(guī)律，可為開發(fā)快速檢測病原菌的培養(yǎng)基配方提供參考。金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)是兼性厭氧的革蘭陽性菌[3]，是醫(yī)院獲得性感染中最常見和食源性疾病的病原體之一。它的毒素和毒力蛋白酶通常在宿主血管中循環(huán)而危及生命，病原體通常在開放性傷口和尿道中生長，導(dǎo)致從輕微的皮膚感染到危及生命的疾病如膿腫、肺炎、腦膜炎、心內(nèi)膜炎和敗血病[4-7]。金黃色葡萄球菌可以生活在惡劣的環(huán)境中，容易污染冷凍食品、水等物品，由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒占的比例較大，成為世界性的公共衛(wèi)生問題[8]。顯然盡可能縮短檢測時間，盡早檢測和鑒定出金黃色葡萄球菌，理論與實(shí)踐價值都較高。本研究選擇金黃色葡萄球菌為指示菌，利用復(fù)合蛋白酶酶解牛肉浸粉，選出最合適的酶組合和酶解條件；通過測定幾種細(xì)菌的生長曲線，考察酶解產(chǎn)物影響微生物生長的特異性；探討產(chǎn)物對金黃色葡萄球菌冷凍負(fù)傷的復(fù)原能力，為牛肉浸粉作為微生物培養(yǎng)基的高價值開發(fā)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料 牛肉浸粉：榮氏生物制品有限公司提供。

1.1.2 菌株來源 金黃色葡萄球菌(Staphylococ-cusaureus)、大腸埃希菌(Escherichiacoli)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)，本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.3 培養(yǎng)基 活化菌株所用固體與液體培養(yǎng)基為相應(yīng)的LB培養(yǎng)基；普通營養(yǎng)培養(yǎng)基：超純水 1 000 mL，蛋白胨10 g，牛肉浸粉3 g，NaCl 5 g；實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基：將普通培養(yǎng)基中的牛肉浸粉替換成經(jīng)酶解處理的；對照組培養(yǎng)基：將普通培養(yǎng)基中的牛肉浸粉替換成原料。

1.1.4 主要試劑 蛋白酶：實(shí)驗(yàn)室采用內(nèi)切蛋白酶與自主專利枯草芽胞桿菌亮氨酸氨肽酶(實(shí)驗(yàn)室自制酶)按一定比例復(fù)配獲得自制復(fù)合蛋白酶；蛋白胨(上海生工)；NaCl(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；瓊脂粉(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；實(shí)驗(yàn)用水：超純水。

1.1.5 主要儀器 立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海花線醫(yī)用核子儀器有限公司；UV-1600PC紫外-可見分光光度計(jì)，上海美普達(dá)有限公司；真空冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；Delter320 pH計(jì)，梅特勒-托利多公司；高速冷凍離心機(jī)CF15RN，日本日立公司；數(shù)顯恒溫磁力攪拌器，江蘇科析儀器有限公司；恒溫?fù)u床，太倉市強(qiáng)樂實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；精確電子天平AL204，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 酶解條件的確定 以配制料液比為8%的溶液，用5.0 mol/L和0.5 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)維持pH的穩(wěn)定，加入復(fù)合蛋白酶(E/S=200 U/g)，50 ℃，此方案為基礎(chǔ)，其中復(fù)合蛋白酶是以金黃色葡萄球菌為指示菌，以試驗(yàn)菌株OD600值的高低[8]選出的最佳配比所復(fù)合的酶[9]。分別酶解改變相應(yīng)的時間、溫度、pH、加酶量和料液比。酶解后的產(chǎn)物，離心取上清液，凍干。將LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)16～18 h金黃色葡萄球菌，分別稀釋到10-4和10-7后，取100 μL加到相應(yīng)實(shí)驗(yàn)組的液體和固體培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min搖床培養(yǎng)和37 ℃平板培養(yǎng)。以24 h后測搖瓶的菌體濃度OD600值和36 h后統(tǒng)計(jì)固體培養(yǎng)基中菌體數(shù)量為指標(biāo), 此條件下的活菌數(shù)與OD600值成正相關(guān)[10]，說明越有利菌株的生長，平板中微生物數(shù)量越多，促進(jìn)作用越明顯[11-12]。考察酶解的不同效果，確定最佳單因素條件，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)獲得最優(yōu)酶解條件[13-14]。

1.2.2 考察最優(yōu)酶解產(chǎn)物促進(jìn)生長的特異性 細(xì)菌生長曲線的測定[9]：將金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌和枯草芽胞桿菌4種微生物，在LB培養(yǎng)基上進(jìn)行活化；在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)16～18 h，按照0.5%的接菌量[14]加入到相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)組和對照組的液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h，每隔2 h搖瓶取樣一次，測OD600，考察酶解產(chǎn)物促進(jìn)作用的特異性。

1.2.3 考察最優(yōu)酶解產(chǎn)物對冷傷菌的復(fù)原能力 挑取在0 ℃斜面上保藏的金黃色葡萄球菌到LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)16～18 h，該時間段的菌處于負(fù)傷狀態(tài)，將原液用無菌水稀釋10-4，從中接250 μL到相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)組和對照組培養(yǎng)基，測OD600[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解條件的確定

2.1.1 酶解時間的單因素實(shí)驗(yàn) 按照1.2.1的方法對氮源牛肉浸粉酶解時間進(jìn)行優(yōu)化。分別酶解1、2、3、4、5 h，其他條件不變，考察不同時間的產(chǎn)物對金黃色葡萄球菌的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 不同酶解時間的產(chǎn)物對金黃色葡萄球菌生長的影響Fig.1 The product of different digestion time effect on the growth of Staphylococcus aureu

由圖1可知，金黃色葡萄球菌的OD600值在酶解的前3 h呈現(xiàn)先減后增；酶解3～5 h區(qū)間，OD600值先減后增。金黃色葡萄球菌在酶解1 h產(chǎn)物上的菌落總數(shù)和酶解3～5 h相應(yīng)產(chǎn)物上的菌落數(shù)接近，變化起伏較小，1 h后的組分對微生物的生長削弱了，產(chǎn)物的促進(jìn)作用減緩。綜合金黃色葡萄球菌的生長狀況，以及成本最小化，選擇酶解時間為1 h。

2.1.2 酶解溫度的單因素實(shí)驗(yàn) 按照1.2.1的方法對氮源牛肉浸粉酶解溫度進(jìn)行優(yōu)化。分別為40、45、50、55 ℃，酶解1 h，其他條件不變。不同溫度的產(chǎn)物對金黃色葡萄球菌在相對應(yīng)培養(yǎng)基上的影響結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同酶解溫度的產(chǎn)物對金黃色葡萄球菌生長的影響Fig.2 The product of different enzyme solution temperature effect on the growth of Staphylococcus aureus

由圖2可知，隨著溫度的變化，OD600值和菌落總數(shù)先增后減，當(dāng)溫度為45 ℃時，兩者達(dá)到最大值。該溫度下的牛肉浸粉利于金黃色葡萄球菌的生長。當(dāng)溫度達(dá)到55 ℃時，OD600值和菌落數(shù)都最低，隨著溫度的升高，復(fù)合酶中的氨肽酶和中性蛋白酶失活加快，導(dǎo)致酶解受阻，影響菌體生長。綜合考慮，選擇 45 ℃作為酶解溫度。

2.1.3 酶添加量的單因素實(shí)驗(yàn) 配制料液比為8%的溶液，pH為8.5，分別加入復(fù)合蛋白酶E/S為100、150、200、250、300 U/g，50 ℃酶解1 h，經(jīng)不同添加量的復(fù)合酶水解后的產(chǎn)物對金黃色葡萄球菌在液體及固體培養(yǎng)基中的生長影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同酶量酶解的產(chǎn)物對金黃色葡萄球菌生長的影響Fig.3 The product of different amount of enzyme digestion effect on the growth of Staphylococcus aureus

由圖3可知，隨著酶量的增加，搖瓶中培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌OD600值和平板菌落數(shù)，先增后減。當(dāng)加酶量為E/S=200 U/g時，達(dá)到最大值。說明此加酶量下酶解所獲產(chǎn)物對其生長最有利。酶量過多或過少的產(chǎn)物都不適合金黃色葡萄球菌的生長。綜合考慮，選擇E/S=200 U/g作為最適加酶量。

2.1.4 pH的單因素實(shí)驗(yàn) 配制料液比為8%的溶液，pH分別為7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，加入復(fù)合蛋白酶E/S=200 U/g。50 ℃酶解1 h，不同pH的酶解產(chǎn)物對金黃色葡萄球菌在相對應(yīng)液體培養(yǎng)基上的OD600值，以及固體培養(yǎng)基上菌落數(shù)量的影響如圖4所示。

圖4 不同pH的酶解產(chǎn)物對金黃色葡萄球菌生長的影響Fig.4 Enzyme solution of different pH′ s influence on the growth of staphylococcus aureus

由圖4可知，隨著pH值的增加，搖瓶中培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌的OD600值先增后減，當(dāng)pH達(dá)到8.0時，OD600值達(dá)到最高值。在相對應(yīng)的平板上，菌落數(shù)呈現(xiàn)下降的趨勢，當(dāng)pH為7.0時，菌落數(shù)達(dá)到最大值。pH的過低或者過高都使得酶呈現(xiàn)不可逆的失活，酶解底物效果差，所得產(chǎn)物對微生物的生長作用相對沒有優(yōu)勢。綜合兩種指標(biāo)的考察，選擇8.0作為酶解的pH。

2.1.5 不同底物濃度的單因素實(shí)驗(yàn) 配制料液比為6%、8%、10%、12%、14%的溶液， pH為8.5，加入復(fù)合蛋白酶E/S=200 U/g。50 ℃酶解1 h，不同底物的酶解產(chǎn)物對金黃色葡萄球菌在相對應(yīng)培養(yǎng)基上生長的影響，如圖5所示。

圖5 不同底物濃度的酶解產(chǎn)物對金黃色葡萄球菌生長的影響Fig.5 The product of different substrate concentration of enzymolysis effect on the growth of Staphylococcus aureus

由圖5可知，隨著物料濃度的增加，搖瓶中培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌的OD600值呈現(xiàn)先減后增的趨勢，當(dāng)物料比達(dá)到14%時，OD600值達(dá)到最大。當(dāng)物料比為10% 時，OD600值最低，但其在相應(yīng)的平板上菌落數(shù)為最大值，說明在此種產(chǎn)物下，搖瓶培養(yǎng)和平板培養(yǎng)兩種形式下，搖瓶培養(yǎng)更有利于金黃色葡萄球菌的生長。綜合考慮，選擇物料濃度為10%作為酶解底物濃度。

2.1.6 可控酶解的正交實(shí)驗(yàn)分析 為了進(jìn)一步優(yōu)化酶解工藝，通過單因素實(shí)驗(yàn)，選擇溫度(A/℃)、加酶量(B/(U·g-1))、pH(C)、底物濃度(D/%)4個因素,進(jìn)行4因素3水平正交實(shí)驗(yàn)，經(jīng)過正交實(shí)驗(yàn)得出的極差，以及生產(chǎn)上的利益最大化和獲得產(chǎn)品的實(shí)際情況，確定一個合理、經(jīng)濟(jì)的組合[16-17]。因素水平表見表1。

表1 因素水平表

以金黃色葡萄球菌的OD600值和平板數(shù)為指標(biāo)，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，結(jié)果分析見表2。

根據(jù)表2可確定各因素對金黃色葡萄球菌生長指標(biāo)影響的主次順序和各指標(biāo)的最優(yōu)水平組合。OD600值：A>C>D>B，A3B2C1D1；菌落數(shù)：A>D>C>B，A1B2C3D3。綜合考慮，對于A因素，因?yàn)?0 ℃有利于酶發(fā)揮最佳活性，所以選擇50 ℃作為酶解溫度；對于C因素，因?yàn)辂}溶度越低越有利于凍干，綜合OD600值和菌落數(shù)，選擇pH 7.5作為酶解條件；對于D因素，綜合兩項(xiàng)指標(biāo)以及經(jīng)濟(jì)效益，選擇底物濃度12%作為最佳酶解條件。最終確定酶解條件為底物濃度12%、50 ℃、pH 7.5、時間1 h、加酶量200 U/g。在最優(yōu)條件酶解下的產(chǎn)物對金黃色葡萄球菌的生長有明顯促進(jìn)作用。

表2 酶解反應(yīng)正交分析結(jié)果

注：K1j、K2j和K3j分別表示“1”、“2”和“3”水平在j列所對應(yīng)的試驗(yàn)指標(biāo)數(shù)值之和(例如第一列中的K11為所有1所對應(yīng)的指標(biāo)數(shù)值之和)，R為j列中平均得率最大的K值與平均得率最小的K值的差值(R=Kmax/3-Kmin/3)

對最優(yōu)酶解條件下的牛肉浸粉多肽分布和氨基酸含量的結(jié)果如圖6和圖7所示。

由圖6可知，經(jīng)過酶解后的牛肉浸粉中多肽分子量小于500 Da的占總量的75.48%，比酶解前增加10.7%，其中小于170 Da的不低于31.79%，說明酶解后產(chǎn)物的多肽分子量主要以小分子居多并且有大量的氨基酸。進(jìn)一步分析氨基酸，發(fā)現(xiàn)主要提升的氨基酸種類如圖7所示，支鏈氨基酸纈氨酸(Val)、異亮氨酸(Ile)和亮氨酸(Leu)的含量，分別是酶解前的3.4倍、2.5倍和1.49倍。支鏈氨基酸是細(xì)菌生理活動的重要營養(yǎng)物質(zhì)，不僅對蛋白合成有關(guān)，在大多數(shù)革蘭陽性細(xì)菌中，支鏈氨基酸是合成支鏈脂肪酸的前體，還是主要的膜脂肪酸[19]。由此得出，可能小分子肽增多和支鏈氨基酸的增加有利于金黃色葡萄球菌的生長。

圖6 酶解前后的多肽分布Fig.6 Peptide distribution before and after enzymatic hydrolysis

圖7 酶解前后氨基酸變化Fig.7 Amino acid changes before and after enzymatic hydrolysis

2.2 酶解牛肉浸粉產(chǎn)物培養(yǎng)細(xì)菌特異性分析

分別用酶解的牛肉浸粉和沒有處理的牛肉浸粉培養(yǎng)幾種不同的細(xì)菌，觀察酶解產(chǎn)物對各菌株生長曲線的影響，結(jié)果如圖8所示。

由圖8可知，對不同的實(shí)驗(yàn)菌株，實(shí)驗(yàn)組與對照組的生長周期大致相同。其中只有a圖金黃色葡萄球菌的生長曲線，在對數(shù)期的OD600值明顯區(qū)別對照組中的，其他三種微生物的對數(shù)期，實(shí)驗(yàn)組和對照組基本沒有差別，d圖可以得到，原料與產(chǎn)物對銅綠假單胞菌作用完全一致。綜合上述，說明通過正交確認(rèn)的最合適酶解條件下的產(chǎn)物，只對金黃色葡萄球菌有促進(jìn)增菌的作用，是具有特異性的。可以用此產(chǎn)物應(yīng)用于富集含有金黃色葡萄球菌的混合菌群的成分之一。

圖8 細(xì)菌生長曲線Fig.8 Growth curve of bacteria

2.3 牛肉浸粉對冷傷菌的復(fù)原能力

經(jīng)過用酶解后的牛肉浸粉配成培養(yǎng)基培養(yǎng)冷凍負(fù)傷的金黃色葡萄球菌，對此菌株的復(fù)原能力如表3所示。

表3 金黃色葡萄球菌的復(fù)原能力

由表3可知，在培養(yǎng)24和36 h后，實(shí)驗(yàn)組中的OD600值遠(yuǎn)高于對照組，并且對照組的菌株幾乎還在延遲期，說明酶解后的牛肉浸粉有利于此菌縮短延遲期，快速進(jìn)入對數(shù)期，有利于冷凍后的菌株復(fù)原，加快增殖。

3 討 論

目前關(guān)于病原微生物檢測雖然有快于常規(guī)檢測的方法，但醫(yī)院傳統(tǒng)常規(guī)培養(yǎng)的方法因其真實(shí)性高而依然應(yīng)用廣泛。當(dāng)然傳統(tǒng)的檢測方法也在不斷地改良中，最重要的改良目標(biāo)就在于縮短所需的檢測時間，其中富集培養(yǎng)基和顯色培養(yǎng)基是重要環(huán)節(jié)。牛肉浸粉作為它們的組成之一，在培養(yǎng)基中往往起到舉足輕重的作用。研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)合蛋白酶對牛肉浸粉酶解優(yōu)化后的產(chǎn)物對金黃色葡萄球菌有明顯相對特異的促生長，這種規(guī)律和特點(diǎn)有利于對不同病原微生物進(jìn)行快速的檢測和區(qū)別。培養(yǎng)冷藏的菌株，發(fā)現(xiàn)該產(chǎn)物對菌株有冷凍復(fù)原的能力，可以盡早使金黃色葡萄球菌恢復(fù)它的生命力及各項(xiàng)機(jī)能，也利于鑒定其屬性。這些作用將不僅利于傳統(tǒng)檢測還可以提高PCR檢測方法的效率[18]。從多肽和氨基酸兩方面進(jìn)行分析，推測多肽小分子偏多，以及經(jīng)過氨肽酶酶解后，亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸的含量增加，都更有利于金黃色葡萄球菌吸收代謝，進(jìn)而對金黃色葡萄球菌的生長起到一定促進(jìn)作用[19-20]。

此蛋白酶酶解調(diào)整技術(shù)應(yīng)用于牛肉浸粉的制備中，可以不斷改進(jìn)牛肉浸粉的品質(zhì)，使其更加有利于微生物的生長。還可以結(jié)合對整體培養(yǎng)基其他成分的作用做進(jìn)一步探討，了解微觀控制微生物培養(yǎng)基成分的方法，便可以更精細(xì)地調(diào)整病原微生物培養(yǎng)基配方，或發(fā)現(xiàn)更特異的培養(yǎng)基配方，使傳統(tǒng)的微生物檢測方法也能得到不斷的改良和提升。