應(yīng)用ELISA和ELFA定量檢測牛奶中葡萄球菌腸毒素A方法的建立

沈菊泉, 歐 杰, 林 露, 陳 敏, 王 婧, 胡潔云, 嚴(yán)維凌*

(1.上海市食品研究所，上海 200235; 2.上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海 201306;3.上海市疾病預(yù)防控制中心，上海 200336)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，以下簡稱金葡菌)在全球范圍內(nèi)都是一種常見的食源性致病菌，其產(chǎn)生的腸毒素(Staphylococcal enterotoxins，SEs)是主要的致病因子，迄今為止已發(fā)現(xiàn)有超過20種的葡萄球菌腸毒素。葡萄球菌腸毒素分子量約為26～30 kDa的蛋白質(zhì)，具有耐熱、耐酸和耐蛋白酶等特點(diǎn)[1-3]。在已發(fā)現(xiàn)的腸毒素中，腸毒素A(SEA)最常見[2-4]。 包括中國和歐盟在內(nèi)的多數(shù)國家和地區(qū)，相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)對食品中的葡萄球菌腸毒素僅需進(jìn)行定性檢測[5-6]，因此目前商業(yè)化的腸毒素檢測試劑盒也都只有定性檢測功能。然而，隨著食品安全定量風(fēng)險評估研究的深入，需要對腸毒素產(chǎn)生的劑量進(jìn)行定量已成為趨勢，即從定性研究逐步發(fā)展到定量研究，特別是近年來發(fā)現(xiàn)的具有高產(chǎn)毒能力的金葡菌菌株[7],可能對研究由金葡菌引起的重大食源性疾病爆發(fā)具有重要的意義，腸毒素的定量檢測方法則成為開展相關(guān)研究必須具備的技術(shù)手段。在目前尚無成熟的定量檢測方法被開發(fā)出來之前，利用已有的定性檢測方法特別是商業(yè)化試劑盒，建立方便可靠的定量檢測手段,不失為一種應(yīng)急的途徑。 目前，葡萄球菌腸毒素的檢測方法有分子生物學(xué)方法(PCR、RT-qPCR、LAMP)[8-9]、免疫學(xué)方法和色譜質(zhì)譜法等。分子生物學(xué)方法僅能檢測是否具有腸毒素基因，并不能證明是否有腸毒素的表達(dá)；色譜質(zhì)譜法在大分子蛋白質(zhì)檢測上尚存在許多難點(diǎn)，因此該方法雖有前途但目前還不成熟；生物傳感器法[10]也已有報道可用于葡萄球菌腸毒素的檢測。迄今為止，基于免疫學(xué)原理開發(fā)的腸毒素檢測技術(shù)是相對最為成熟的方法，國內(nèi)外已經(jīng)有很多的研究報道[11-15]，但真正的商業(yè)化產(chǎn)品卻不多。目前市場上可供應(yīng)的產(chǎn)品主要有基于雙抗體夾芯ELISA方法的Tecra SEs SET、Ridascreen SET和TRANSIA PLATE，基于酶聯(lián)熒光(ELFA)原理的Vidas SET2以及基于乳膠凝集原理的SET-RPLA[15]。其中雙抗體夾芯ELISA和ELFA的檢測結(jié)果以顏色或熒光強(qiáng)度表示，其顏色或熒光強(qiáng)度在一定范圍內(nèi)與底物濃度相關(guān)，因此在原理上有可能建立起定量檢測方法。然而到目前為止，雖然對于這兩種方法用于腸毒素定性檢測的驗(yàn)證和比較已經(jīng)有相關(guān)的報道[16]，但對于這兩種方法在用于腸毒素定量檢測方面的研究及分析比較，國內(nèi)外至今尚無這方面的研究報道。為了方便快捷地建立起食品中葡萄球菌腸毒素的定量檢測手段，本研究選擇了基于雙抗體夾芯ELISA原理的Tecra SEs SET和基于ELFA方法的Vidas SET2這兩種腸毒素檢測試劑盒，分析研究兩者用于定量檢測腸毒素A(SEA)的可行性，這兩種試劑盒都符合AOAC相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[17-18]，可以定性檢測食品中是否存在A、B、C1、C2、C3、D和E這七種常見腸毒素(但不能進(jìn)行分型)。實(shí)驗(yàn)對這兩種試劑盒在定量檢測SEA時的檢出限、校正曲線范圍和回收率等指標(biāo)進(jìn)行了分析比較，為有關(guān)實(shí)驗(yàn)室建立腸毒素定量檢測手段提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源 產(chǎn)腸毒素A(SEA)的金黃色葡萄球菌株SA14966，保藏于上海市食品研究所。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基，北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

1.1.3 試劑及儀器 全脂牛奶(950 mL裝，光明優(yōu)倍)；高純度葡萄球菌腸毒素A(SEA)標(biāo)準(zhǔn)品(AT101，Toxin Technology公司)； Tecra SEs SET葡萄球菌腸毒素微孔板法試劑盒(3M公司)；Vidas SET2葡萄球菌腸毒素檢測試劑盒(Biomérieux公司)；Multiskan FC酶標(biāo)儀(ThermoFisher公司)；全自動熒光免疫分析儀(mini Vidas, Biomérieux公司)；5430R高速離心機(jī)(Eppendorf公司)；H-2050R高速冷凍離心機(jī)(湘儀公司)。

1.2 方法

1.2.1 校正曲線的繪制及檢出限的確定 腸毒素A標(biāo)準(zhǔn)品配置成濃度為50 μg/mL的母液，凍藏，使用時用一級超純水進(jìn)一步稀釋定容成100 ng/mL的工作母液備用。①Tecra SEs SET法：根據(jù)Tecra SEs SET的使用說明[17]，牛奶無需預(yù)處理，可直接加反應(yīng)液顯色檢測。因此本研究直接采用全脂牛奶作為基質(zhì)，加入毒素工作母液配置成毒素濃度為0、0.25、0.50、1.0、2.5、5.0、10 ng/mL等7個濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液。待測樣品按說明書要求分別添加反應(yīng)液及相關(guān)程序操作，反應(yīng)物用酶標(biāo)儀檢測(414±10)nm處的吸光度(AV值)，重復(fù)6次。根據(jù)檢測結(jié)果繪制校正曲線。②Vidas SET2法：根據(jù)Vidas SET2使用說明[18]，牛奶需除蛋白質(zhì)后再上機(jī)檢測。本研究按要求使用5 mol/L HCl調(diào)整全脂牛奶pH值至4.0，于18～25 ℃靜置15～30 min，將懸濁液于18～25 ℃采用3 000～5 000 g離心15 min，將上清液通過浸濕的棉花壓出，使用1 mol/L氫氧化鈉調(diào)整濾液pH至7.5～8.0之間。將經(jīng)預(yù)處理獲得的濾液作為基質(zhì)，加入毒素工作母液配置成毒素濃度為0、0.125、0.25、0.50、1.0、2.5和5.0 ng/mL等7個濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后按使用說明的要求送入mini Vidas檢測。檢測結(jié)果為樣品和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)相對熒光值的比值，以TV值表示，重復(fù)6次。根據(jù)檢測結(jié)果繪制校正曲線。根據(jù)校正曲線，計算出AV或TV值達(dá)到陽性臨界值所需的SEA濃度，即為檢出限。

1.2.2 加標(biāo)回收率檢測 ①Tecra SEs SET法：根據(jù)校正曲線及臨界AV值推算出檢出限。以全脂牛奶為基質(zhì)，加入腸毒素工作母液配置成檢出限、2.5倍檢出限、10倍檢出限濃度的待測樣品，按使用說明要求分別添加反應(yīng)液及相關(guān)程序操作，反應(yīng)物用酶標(biāo)儀檢測(414±10)nm處的吸光度(AV值)，重復(fù)6次，其平均值與加標(biāo)濃度的比值即為回收率。②Vidas SET2法：以全脂牛奶為基質(zhì)，加入腸毒素工作母液配置成檢出限、2.5倍檢出限、10倍檢出限濃度的待測樣品，參照1.2.1中②的方法預(yù)處理后，用mini Vidas檢測，所獲TV值代入校正曲線公式獲得實(shí)際檢測濃度，重復(fù)6次，其平均值與加標(biāo)濃度的比值即為回收率。

1.2.3 腸毒素A陽性樣品的制備和檢測 ①菌種活化培養(yǎng)：將凍藏的產(chǎn)腸毒素A(SEA)的金黃色葡萄球菌株(SA14966)菌液解凍，取0.1 mL菌液加入50 mL已經(jīng)滅菌的LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)，劃線分離后置于(37±1) ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h得到單菌落。②菌種原液制備：從單菌落挑取一環(huán)接種于滅菌的LB 培養(yǎng)基中，100 r/min、(37±1) ℃培養(yǎng)，16～18 h；吸出50 mL菌液離心(10 000 r/min，(4±0.1) ℃，20 min)；棄上清液后，細(xì)胞沉淀加入冷的50 mL滅菌的0.1 mol/L磷酸鉀緩沖液(K2HPO4-KH2PO4，pH=7)混勻；離心(10 000 r/min，(4±0.1) ℃，20 min)；棄上清液；上述操作再重復(fù)一次得到菌種原液[19]。③腸毒素A陽性樣品檢測：將金黃色葡萄球菌菌液接種于經(jīng)滅菌的全脂牛奶中，初始濃度約為103cfu/mL，置于(37±1) ℃環(huán)境下培養(yǎng)18、24和30 h，分別用Tecra SEs SET和Vidas SET2檢測腸毒素濃度，重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 Tecra SEs SET(ELISA方法)對SEA標(biāo)準(zhǔn)溶液檢測結(jié)果

采用Tecra SEs SET葡萄球菌腸毒素檢測試劑盒對SEA標(biāo)準(zhǔn)溶液檢測，結(jié)果見圖1。

圖1 采用Tecra SEs SET獲得的SEA濃度與吸光度的校正曲線Fig.1 Calibration curve of SEA concentration vs Absorbance value using Tecra SEs SET

圖1顯示在0～10 ng/mL腸毒素(SEA)濃度范圍內(nèi)，Tecra SEs SET試劑盒檢測結(jié)果的吸光度與SEA濃度呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r=0.997，擬合的線性回歸方程：SEA(ng/mL)=5.600 1×AV-0.328 5。在該濃度范圍內(nèi)，實(shí)驗(yàn)的精密度良好，7個濃度水平所測得的AV值的變異系數(shù)均小于5.0%。TECRA SEs SET對陽性樣品判斷的AV臨界值為0.2，即只有當(dāng)AV≥0.2的樣品才能判斷為腸毒素陽性。根據(jù)校正曲線公式計算，AV=0.2時的SEA濃度為0.79 ng/mL，即0.79 ng/mL為該方法的檢出限，因此實(shí)際應(yīng)用于牛奶中腸毒素A定量檢測時標(biāo)準(zhǔn)曲線的有效范圍為0.79～10 ng/mL。根據(jù)檢出限，以全脂牛奶的基質(zhì)，配置成腸毒素A濃度為0.80、2.5和10 ng/mL的待測樣品做加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明(表1)，腸毒素的加標(biāo)回收率均符合GB/T27404-2008規(guī)定的要求。

表1 Tecra SEs SET的加標(biāo)回收率(n=6)

2.2 Vidas SET2(ELFA方法)對SEA標(biāo)準(zhǔn)溶液檢測結(jié)果及加標(biāo)回收率

采用Vidas SET2對SEA標(biāo)準(zhǔn)溶液檢測結(jié)果見圖2。

圖2顯示在0～5.0 ng/mL腸毒素A(SEA)濃度范圍內(nèi)，Vidas SET2檢測結(jié)果(TV值)與SEA的濃度的關(guān)系，可以看出TV值與SEA的濃度在該范圍內(nèi)并不總是呈良好的線性關(guān)系。在0～1.0 ng/mL濃度范圍的TV值與SEA的濃度的相關(guān)系數(shù)r=0.998，相關(guān)性良好，擬合的線性回歸方程：SEA(ng/mL)=0.848 8×TV-0.023 9；0～2.5 ng/mL濃度范圍的相關(guān)系數(shù)r=0.983，相關(guān)性略低，但對于痕量檢測，可以接受；而0～5.0 ng/mL濃度范圍的r=0.930，無法接受。重復(fù)性試驗(yàn)顯示精密度良好，7個濃度水平所測得的TV值變異系數(shù)均小于5.0%。Vidas SET2葡萄球菌腸毒素檢測試劑盒對陽性樣品判斷的TV臨界值為0.13，當(dāng)TV≥0.13的樣品才能判斷為腸毒素陽性。根據(jù)0～1.0 ng/mL濃度范圍的線性回歸方程，TV=0.13時的SEA濃度為0.09 ng/mL，即檢出限為0.09 ng/mL，這與Hennekinne等[16]的研究結(jié)果0.062 5 ng/mL接近，因此應(yīng)用于定量檢測時校正曲線的有效范圍為0.09～1.0 ng/mL。根據(jù)檢出限，腸毒素A濃度為0.10、0.25 ng/mL和1.0 ng/mL的待測樣品做加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明(表2)，腸毒素的加標(biāo)回收率均符合GB/T27404-2008規(guī)定的要求。

圖2 采用Vidas SET獲得的SEA濃度與TV值的關(guān)系(n=6)Fig.2 The Calibration curve of SEA concentration vs Absorbance value using Vidas SET(n=6)實(shí)線：TV值的變化趨勢線；虛線1：SEA濃度范圍為0～1.0 ng/mL的校正曲線；虛線2：SEA濃度范圍為0～2.5 ng/mL的校正曲線；虛線3：SEA濃度范圍為0～5.0 ng/mL的校正曲線Solid line with：was the trend of the test value，dash line1 was the calibration curve at the SEA concentration ranged from 0-1.0 ng/mL, dash line2 was the calibration curve at the SEA concentration ranged from 0-2.5 ng/mL, dash line3 was the calibration curve at the SEA concentration ranged from 0-5.0 ng/mL

SEA加標(biāo)濃度/(ng·mL-1) 平均SEA檢測濃度/(ng·mL-1)變異系數(shù)/%回收率/%0.100.094.8900.250.244.9951.00.512.2104

2.3 陽性樣品的檢測結(jié)果及比較

將產(chǎn)腸毒素A的金黃色葡萄球菌菌株接入牛奶中于(37±1) ℃環(huán)境下培養(yǎng)，分別在18、24和30 h時測定腸毒素A(SEA)的濃度(n=3)，結(jié)果見圖3。在18和24 h時，SEA濃度低于Tecra SEs SET的檢測限，僅能被Vidas SET2檢出，在18和24 h時檢出濃度分別為(0.48±0.01)和(0.55±0.02) ng/mL。在30 h時，SEA可以同時被Tecra SEs SET和Vidas SET2檢出，采用Tecra SEs SET檢出的濃度為(1.72±0.08) ng/mL，Vidas SET2檢出的濃度為(1.59±0.03) ng/mL，兩者十分接近。

圖3 采用Terca SEs SET和Vidas SET2對牛奶中葡萄球菌腸毒素A(SEA)濃度的檢測結(jié)果(n=3)Fig.3 The SEA concentration in milk during incubation detected by Terca SEs SET and Vidas SET2(n=3)

3 討 論

研究結(jié)果顯示，Terca SEs SET和Vidas SET2兩種腸毒素定性試劑盒用于牛奶中葡萄球菌腸毒素A的定量檢測，無論在精密度、回收率以及校準(zhǔn)曲線方程的相關(guān)系數(shù)等都基本滿足《GB/T27404-2008 實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》的要求。由于這兩種試劑盒都是商業(yè)化產(chǎn)品，相關(guān)實(shí)驗(yàn)室可以方便快捷地利用它們建立起SEs的定量檢測條件。Tecra SEs SET只需配套酶標(biāo)儀，對檢測設(shè)備硬件投入要求低，Vidas SET2需要配套全自動熒光免疫分析儀，但檢測耗材相對便宜。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)Tecra SEs SET有更廣的線性范圍，而Vidas SET2則具有更高的靈敏度，其檢出限和校正曲線范圍要比Terca SEs SET低一個數(shù)量級，但兩者又無縫銜接，因此在定量檢測時可以根據(jù)樣品不同SEA濃度選擇合適的試劑盒。

需要特別說明的是，根據(jù)Terca SEs SET和Vidas SET2這兩種試劑盒的原理[17-18]，除了SEA，還可用于定量檢測其他六種常見腸毒素。然而，由于這兩種試劑盒使用多克隆抗體，不能對這七種腸毒素予以分型[20]，因此僅能在食品中只有其中一種腸毒素且類型已知的情況下才能用于定量檢測。另外，免疫學(xué)方法雖然具有靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，但依然存在假陽性或假陰性的缺點(diǎn)，如果食品中殘留大量的與試劑盒標(biāo)記的酶(如過氧化物酶或堿性磷酸酶等)相同的酶，很有可能導(dǎo)致假陽性；同時某些食品加工過程如加熱可引起腸毒素凝聚，造成其與抗體的反應(yīng)性降低，但其生物活性可能依然保留，由此導(dǎo)致假陰性的出現(xiàn)[15]。鑒于免疫學(xué)方法存在缺陷，近幾年各國科學(xué)家開始探索采用色譜結(jié)合質(zhì)譜方法檢測腸毒素并取得了一些進(jìn)展[21-22]，雖然該方法的檢測硬件條件比免疫學(xué)方法要求高，且目前技術(shù)尚不成熟，但這仍然是發(fā)展趨勢。