纖維素降解菌的分離篩選及對中藥廢棄物的固相發酵研究

常 帆，上官亦卿， 呂 睿， 丁 浩， 賈鳳安

(陜西省微生物研究所 微生物代謝產物研究中心，陜西 西安 710043)

木質纖維素(Lignocellulosic biomass)是一類高分子結構復雜的生物質[1]，其中纖維素、半纖維素和木質素是木質纖維素類物質的主要的三種組分，其中纖維素分子通過氫鍵形成牢固的網狀結構，有些與木質素交聯在一起，難以轉化利用。現已發現自然界中包括細菌、真菌、放線菌等多種微生物對木質纖維素類物質有降解作用[2-4]，而利用不同微生物組成功能菌系聯合降解木質纖維素類物質是當今研究的熱點[5-6]。中藥廢棄物(Chinese medicinal herbal residues)主要來源于中藥材的加工、炮制、提取等過程[7-8]，非入藥部位通常歸為廢料簡單丟棄或焚燒。而中藥廢棄物中富含木質纖維素類物質，同時還含有多糖類、蛋白質、脂類、黃酮類、生物堿以及多種微量元素等大量可再利用的營養成分[9]，利用固相發酵手段發揮微生物對木質纖維素類的生物降解作用，增加中藥廢棄物活性成分的釋放，充分利用中藥藥渣的生物質資源，是解決提高中藥廢棄物精細高值化利用的新思路。本研究篩選到16株對纖維素有降解效果的菌株，對8株有明顯作用的菌株的纖維素酶活性進行了初步研究，并以中藥廢棄物為基質，利用5株細菌、3株真菌固相發酵檢驗其降解木質纖維素的效果，為之后的菌系構建和聯合降解提供研究基礎，同時為利用中藥廢棄物生產生物有機肥料和微生物飼料提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 中藥廢棄物：來源于陜西中醫醫院；土壤樣本：來源于陜西省微生物研究所采自陜西境內各種生境的土壤；引物為北京六合華大基因科技有限公司合成。

1.1.2 培養基(g/L) ①營養瓊脂培養基(NA)：牛肉膏3.0，蛋白胨10.0，NaCl5.0，瓊脂15.0， pH 7.3；②富集液體培養基：濾紙片20 g，(NH4)2SO41.4，K2HPO42.0，MgSO40.3，MnSO41.6，CaCl20.3，FeSO45.0 mg/L，ZnCl21.7 mg/L，pH 5.5；③赫奇遜固體培養基：KH2PO4l.0，MgSO4·7H2O 0.3，NaCl 0.1，FeCl20.01，CaCl2·H2O 0.1，NaNO32.5，瓊脂15.0。倒平板后在平板上覆蓋滅菌圓形濾紙片；④羧甲基纖維素培養基：CMC-Na 15.0，K2HPO4l.0，NH4NO3l.0，MgSO4·7H2O 0.5，NaCl 0.5，瓊脂15.0；⑤剛果紅培養基：CMC-Na 2.0，(NH4)2SO42.0，K2HPO41.0，MgSO4·7H2O 0.5，剛果紅0.4，瓊脂15～20，pH 7.0。以上使用試劑均為分析純，上述培養基及材料均經過121 ℃滅菌30 min后待用。

1.2 方法

1.2.1 纖維素降解菌的生物富集及篩選 稱取5 g土壤樣品，加入富集液體培養基中，30 ℃ 180 r/min振蕩培養富集2 d。富集培養后樣品進行梯度稀釋后從10-3～10-7倍的稀釋液中各取0.1 mL，涂布于羧甲基纖維素培養基，30 ℃ 180 r/min培養3 d，每隔24 h觀察菌落生長情況。然后挑取對羧甲基纖維素培養基中濾紙能夠降解的菌落，-80 ℃保存。將菌種接種于NA中活化后點接于羧甲基纖維素培養基上，30 ℃培養2～4 d，0.5 g/L剛果紅染色5 min，1 mol/L 的NaCl溶液7～10 mL脫色30 min。以透明圈的直徑計算CMC酶的相對活性。利用3,5-二硝基水楊酸法(DNS法)測定β-葡聚糖苷酶活力(CMCase)。以1 mg酶每分鐘催化纖維素水解生成葡萄糖微克數定為一個活力單位。計算方法如下：

N：酶液稀釋倍數；T：糖化所用時間；1：反應酶液mL數。

1.2.2 纖維素降解菌的鑒定 對獲得菌株純培養后，提取DNA，然后進行PCR擴增。菌株的分子生物學鑒定：對獲得的菌株純培養后進行菌落 PCR。鑒定細菌所用的特異性通用引物27f (5′-AGAGTTTGATCCTTGGCTCAG-3′)和 1492r (5′-ACGGTTACCTTACGACTT-3′)進行菌落PCR擴增 16S rDNA基因。反應體系(25 μL)：2×PCR 緩沖液12.5 μL，無菌水11 μL，引物各1 μL，模板挑肉眼可見單克隆。PCR擴增條件：94 ℃預變性10 min ，94 ℃變性1 min，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸1.5 min，35個循環，72 ℃延伸3 min，PCR產物于4 ℃下存放。反應產物瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，送六合華大基因公司測序。鑒定真菌所用的特異性引物NL1 (5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′)和NL4(5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′)擴增26S rRNA基因反應體系(50 μL)：2×PCR Buffer 25 μL，無菌水22 μL，引物各1 μL，模板菌體肉眼可見。PCR擴增條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個循環后72 ℃延伸3 min，產物于4 ℃下存放。反應產物瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，送六合華大基因公司測序。

1.2.3 降解細菌固態發酵中藥廢棄物的效果實驗 上述篩選到的微生物按5%的比例接種于NA中，培養2～5 d，在中藥廢棄物中添加5%的豆粕作為補充氮源，將種子液按10%比例分別接種于中藥廢棄物中。取若干塑料盒，并在其側面開設通風孔，確保中間的位置可以插入溫度計。取適量中藥廢棄物，接入菌體后，進行淺盤發酵，每間隔一天分別讀取堆體溫度、pH、含水量。上述實驗結果均利用Office Excel 2010和GraphPad Prism 5軟件作圖并分析。

2 結果與分析

2.1 纖維素降解菌的篩選

將初篩獲得的菌株進行剛果紅染色(圖1)，可以發現有菌株產生了明顯的透明圈，且透明圈大小不一，提示不同菌株對纖維素降解效果有強弱。

以細菌透明圈直徑平均值/菌落直徑平均值>2 cm、真菌透明圈直徑平均值/菌落直徑平均值>1 cm為標準，篩選得到7株高效纖維素降解細菌(表1)。可以看到7株細菌對纖維素降解效果較強，其中1#、2#、5#、8X01、13X03效果較好，除1#外透明圈直徑平均值/菌落直徑平均值均高于3(1#為2.92)，透明圈直徑和菌落直徑均較大；同時真菌的降解效果較弱，多數真菌隨菌絲體長勢降解纖維素，透明圈直徑平均值/菌落直徑平均值接近1；其中7z02、8z02、18z02菌株分泌纖維素酶類至固體培養基中，降解效果較明顯。說明細菌利用培養基中纖維素并生長旺盛，而真菌因生長周期的緣故降解較慢。

圖1 纖維素降解細菌、真菌的篩選Fig.1 Degradation of cellulose degradation bacteria and fungi

菌落編號透明圈直徑D1/cm透明圈直徑D2/cm菌落直徑d1/cm菌落直徑d2/cm透明圈直徑/菌落直徑1#2.12.00.90.52.922#2.62.50.90.73.194#4.03.82.01.62.175#3.12.61.10.73.178X013.33.21.20.93.1011X011.71.50.80.52.4613X031.30.70.30.24.007z014.54.44.34.21.047z024.64.93.23.11.507z033.43.33.23.31.037z044.34.03.73.51.158z025.55.43.43.01.709z013.13.23.13.11.0111z014.24.34.34.21.0018z013.53.43.33.21.0618z022.52.62.02.11.20

2.2 纖維素降解菌的復篩

在赫奇遜培養基中培養不同時間，利用DNS法檢測不同菌株在不同時間的纖維素酶活性，在540 nm的光吸收值對標準曲線計算，即可確定還原糖產生的量，用以確定以下酶活力單位?？梢园l現，與初篩結果相似，細菌在培養初期就展現較高的CMCase活性，而隨著培養時間的增加，不同菌株展現出不同的產纖維素酶能力，其中細菌1#、2#、5#、13X03隨著培養時間的增加酶活不斷增加；而細菌4#、11X01隨著培養時間達到4 d后，酶活開始下降；細菌8X01在培養2 d后酶活一直持續在一定水平。4 d時1#菌CMCase酶活最強，達到1 560.5 u/mL。發現細菌1#、2#、5#和13X03在生長過程中，纖維素酶活力一直在升高，在4 d時1#和5#的CMC酶活性明顯高于其他菌株。而菌株在培養過程中CMCase的變化也提示在降解纖維素類物質的過程中應發揮不同菌株的特性聯合降解。

圖2 細菌CMCase活性隨培養時間的變化Fig.2 The results of bacterial CMCase activity changes with culture time

圖3為真菌培養時CMCase活性變化情況。因真菌生長周期較長等因素，影響真菌產纖維素能力，但5 d后各真菌纖維素酶產酶活性均高于3 d，其中7z02、8z02、18z02三株真菌在5 d時表現出較高的酶活力和較快的產酶變化率。

圖3 真菌CMCase活性隨培養時間的變化Fig.3 The results of fungalCMCase activity changes with culture time

2.3 纖維素降解菌的鑒定

將酶活較高的不同菌株(細菌：1#、2#、5#、8X01、13X03；真菌：7z02、8z02、18z02)PCR產物送華大基因測序，得到不同的測序序列，用Blast程序比對，得到序列同源性達到99%的鑒定結果，見圖4。

圖4 降解纖維素細菌系統進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of lignocellulolyticbacteria

由圖4可知，1#、2#、5#均為Bacillus屬，其中1#、2#可能為Bacillusmethylotrophicus，而5#可能為Bacillussubtilis。因Bacillus屬種間進化關系非常相近，所以需要利用脂肪酸代謝、DNA雜交等手段進一步確定其進化關系。Bacillus降解纖維素類物質的相關報道很多[10-11]，部分是由腸道系統分離得到的[12]，本研究由土壤中分離到纖維素降解菌，因缺乏腐殖質的新造土壤為原生環境，利用潛力較大。8X01菌株經鑒定為Streptomyces屬，可以看到其與Streptomycesgriseovifidis和Streptomycesniveoruber聚為一簇，提示可能屬于其中的一種；報道發現Streptomyces屬除產生多種抗生素外，還能產生纖維素酶類物質[13]，在原始森林土壤中也發現大量Streptomyces屬放線菌，提示在腐殖質豐富的基質中放線菌也擁有潛在的作用。13X03菌株與Enterobacter屬最為接近，Enterobacter屬與Klebsiella屬有較近的親緣關系，Raoultella屬是Klebsiella屬的分支；Enterobacter屬對纖維素半纖維素類物質的降解作用相關研究早有報道[14-15]，Manfredi 等[16]在昆蟲腸道中分離出45株具有較強降解能力的菌株，發現Enterobacter屬是降解菌中比較大的一個類群。且Enterobacter屬已被應用于構建纖維素發酵菌系[17]的相關研究中。

圖5 降解纖維素真菌系統進化樹Fig.5 Phylogenetic tree of lignocellulolyticfungus

真菌鑒定結果見圖5，由圖5可以看出7z02與Ascomycete屬、Nectria屬較為接近，Ascomycete屬具有分泌纖維素酶的能力[18-19]，是纖維素降解菌系的主要類群之一，Nectria屬不僅能分泌纖維素酶類，還能利用氨基酸進行代謝[20]。8z02經鑒定建樹發現其與Aspergillus屬最接近，親緣關系達到99%以上；曲霉對纖維素降解的研究是近年來的研究熱點[21-22]，其中利用曲霉[23]降解纖維素的機制和提高降解效率研究是當今重點問題。本研究中篩選出的8z02菌株降解效率較強，同時能長時間維持較高的纖維素酶活性，有一定的開發利用價值。18z02菌株與Trichosporon屬親緣關系達99%以上，Trichosporon屬報道發現其與其他細菌、真菌組成降解菌系聯合降解纖維素類物質[24]，并能富集蛋白。

2.4 降解細菌固態發酵中藥廢棄物的效果

利用分離出的有纖維素降解能力的微生物，不同細菌、真菌單獨添加10%(體積分數)后對中藥藥渣發酵腐熟的效果不同。細菌對中藥廢棄物發酵過程中溫度、pH的變化見圖6?？梢钥吹桨l酵的4 d，相比中藥廢棄物在自然腐熟(CK組)，接入降解功能菌株的堆體均有不同程度的升溫，其中1#和13X03菌株達到48 ℃，pH也下降至6.3。但4 d后堆體溫度均開始下降，同時pH變化波動較小，說明細菌對中藥廢棄物腐熟過程作用較小，在前期首先利用中藥廢棄物中速效C、N源快速生長。

圖6 細菌固相發酵中藥廢棄物溫度和pH變化Fig.6 Temperature and pH changes of bacterial Chinese medicinal herbal residuessolid fermentation

圖7 真菌固相發酵中藥廢棄物溫度和pH變化Fig.7 Temperature and pH changes of fungal Chinese medicinal herbal residuessolid fermentation

利用真菌分泌的纖維素酶系和自身菌絲體的延伸作用，真菌對纖維素類物質降解效果要遠大于細菌。從圖7可見，不同菌株對于固態發酵纖維素類含量較多的中藥廢棄物效果是不同的。中藥廢棄物在自然腐熟的狀態下(CK組)，溫度緩慢上升，7～10d達到最高溫度28 ℃，之后自然下降至22 ℃。相對于CK組，8z02的曲霉屬菌株在發酵4 d時堆體溫度可達到52 ℃，是篩選到的纖維素降解菌株中最高的，之后緩慢下降，16 d時仍保持堆體溫度達32 ℃，同時pH緩慢上升至6.8，與發酵過程氧氣消耗較快，堆體進入氨化過程有關。7z02菌株發酵后期10 d時溫度達到47 ℃，發酵腐熟后期16 d仍保持38 ℃。18z02菌株雖發酵溫度上升較慢發酵最高溫度較低，但在發酵中后期其他堆體溫度下降的情況下仍能上升至42 ℃。pH在發酵過程中均有不同程度的上升，這與堆體未進行翻堆，堆體內部缺氧造成的氨化作用有關，應在腐熟過程中進行翻堆作業并保持通風。固相發酵過程中堆體溫度和pH是發酵腐熟的關鍵，本研究發現不同菌株對堆體發酵溫度的作用各有差異，提示可利用其建立發酵菌系，提高腐熟效率。

堆體溫度在一定程度上可以反映出微生物菌劑對堆肥進程的影響，隨著時間的增加，有機物漸漸降解，微生物數量下降，代謝活動減弱，堆體溫度也逐漸達到室溫，堆肥進入腐熟階段。pH是堆肥中微生物生長的關鍵影響因素之一。在整個堆肥進程中，堆料的pH值增加，可能表示堆料中有機物易降解蛋白含量較大，被微生物利用分解為堿性氨氣，導致氨氣大量釋放所致；堆料的pH值下降，可能表示堆料中有大量有機質的分解產生有機酸，有機酸的大量積累導致堆料pH值逐漸降低。

3 討 論

目前我國中藥材年產量約7 500萬t[9]，而生產加工過程中產生的中藥固體廢棄物近50%～70%[7]。通過微生物的發酵作用，轉化中藥廢棄物是實現中藥廢棄物高值化利用的有力手段；基于生物發酵技術的中藥廢棄物開發，是解決中藥廢棄物造成的生態環境問題和中藥資源開發合理化應用的新方式。但由于微生物發酵過程中對菌株或菌群的篩選、中藥廢棄物來源多樣性和發酵工藝的穩定性、安全性等問題，仍需要更深層次的探索。本研究篩選到8株對木質纖維素類物質有明顯降解效果的菌株，經鑒定分別為在木質纖維素降解中能單獨或配合發揮較強作用的菌株，在單獨固相發酵中藥廢棄物過程中發揮了顯著作用，對發酵過程中堆體溫度和pH等參數提高明顯，對加速中藥廢棄物轉化腐熟起到關鍵作用。同時發現不同的微生物對堆體腐熟效果也有區別，在后續的研究中應利用其各自優勢形成降解細菌-真菌的微生態菌系，增強降解效應。