咀嚼力對(duì)青齡期大鼠牙槽骨胰島素樣生長(zhǎng)因子-1、骨保護(hù)素、核因子kB受體活化因子配體蛋白表達(dá)的影響

李淑嫻，馬宗民，孫雨辰，王學(xué)金

（1.大連大學(xué) 機(jī)械工程學(xué)院，遼寧 大連 116622；2.大連大學(xué) 研究生院，遼寧 大連 116622；3.大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院，遼寧 大連 116601）

0 引言

頜骨作為頜面部的骨性支架，構(gòu)成頜面部輪廓外形，具有與咬合、咀嚼、語(yǔ)言和保持呼吸道暢通等生理功能。骨組織有力學(xué)適應(yīng)性，頜骨為承受咀嚼載荷的骨器官，它的生長(zhǎng)發(fā)育除受到遺傳因素影響外，還與所處的力學(xué)環(huán)境密切相關(guān)。骨在整個(gè)生命過(guò)程都在不斷的重建中,頜骨骨代謝活躍、骨轉(zhuǎn)換率高。力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是骨重建的關(guān)鍵環(huán)節(jié),是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)[1]。研究發(fā)現(xiàn)，骨重建受到胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（IGF-1）、骨保護(hù)素（OPG）/核因子kB受體活化因子配體（RANKL）等多種分子信號(hào)系統(tǒng)的調(diào)控，并且不同分子信號(hào)系統(tǒng)之間存在協(xié)同關(guān)系[2-8]。力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)多見(jiàn)體外實(shí)驗(yàn)研究，體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究IGF-1、OPG/RANKL及其關(guān)系的暫不多見(jiàn)。本研究通過(guò)喂食不同硬度的飼料，建立不同強(qiáng)度力學(xué)刺激SD大鼠牙槽骨動(dòng)物模型，分析不同強(qiáng)度力學(xué)刺激對(duì)牙槽骨微結(jié)構(gòu)、IGF-1、OPG和RANKL表達(dá)的影響及它們之間的關(guān)聯(lián)性，探討力學(xué)信號(hào)在骨重建中的傳遞，揭示頜骨力學(xué)適應(yīng)性的機(jī)制，深入研究頜骨骨重建，對(duì)口腔相關(guān)領(lǐng)域有一定的臨床意義。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雌性SD大鼠，健康、牙列完好，2月齡，體重200～240 g，大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證（SCXK（遼）2008—0002）。

1.2 試劑與儀器

PVDF 膜 (美 國(guó) Millipore公 司 )；IGF-1、OPG、RANKL和β-actin抗體（Abcam 公司）；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗兔及抗鼠二抗(Santa Cruz生物工程公司)；細(xì)胞培養(yǎng)箱、超凈臺(tái)(美國(guó)Forma Scientific公司)；低溫離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司)；PERFECTION1270凝膠影像分析儀(美國(guó))；Nikon300型自動(dòng)攝像倒置顯微鏡(美國(guó)Nikon公司)；電子天平(德國(guó)Sartorius公司)，微量加樣器（法國(guó)Gilson公司），去離子水儀（美國(guó)PALL,Purelab Plus公司）等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 分組與處理

40只雌性SD大鼠隨機(jī)平均分為：軟食組、硬食組。飼料在江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司定制，營(yíng)養(yǎng)成分一致（符合標(biāo)準(zhǔn)GB14924.3-2010）。大鼠適應(yīng)性常規(guī)喂養(yǎng)1周后開(kāi)始分級(jí)喂養(yǎng)。兩組大鼠在分級(jí)喂養(yǎng)2月、4月分兩次處死，取兩側(cè)下頜骨，剔除軟組織后一側(cè)下頜骨置入10%中性福爾馬林液中浸泡固定，另一側(cè)置入-80℃冰箱保存，備用。

1.3.2 指標(biāo)檢測(cè)與方法

（1）骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo)檢測(cè)

利用Siemens Inveon MultiModality System顯微CT機(jī)掃描重建大鼠下頜骨，掃描條件為：電壓80 kV、電流450 μA、分辨率15.48 μm，檢測(cè)骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)，骨小梁數(shù)量(Tb.N) ，骨小梁分離度(Tb.Sp)，骨小梁厚度(Tb.Th)等骨形態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo)。

（2）IGF-1、OPG和RANL蛋白表達(dá)檢測(cè)

Western blot測(cè)定下頜骨第三磨牙區(qū)牙槽骨組織中OPG、RANKL蛋白表達(dá)：將組織研碎、裂解提取組織蛋白。采用10%SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉，4℃孵育一抗過(guò)夜，漂洗充分后孵育二抗，免疫反應(yīng)條帶用ECL法顯影，UVP分析儀(PERFECTION1270) 掃描曝光膠片。采用Image-Pro Plus軟件進(jìn)行灰度測(cè)定，分析蛋白相對(duì)表達(dá)量，目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平＝目的蛋白灰度值／內(nèi)參灰度值，以3次重復(fù)檢測(cè)所得平均值為該樣本目的蛋白表達(dá)水平

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所得數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用SPSS18.0進(jìn)行獨(dú)立變量T撿驗(yàn)，設(shè)定P＜0.05差異具有顯著性；Spearman 線(xiàn)性相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 骨形態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo)

表1和表2是分別是下頜骨第三磨牙區(qū)骨形態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果。從結(jié)果可以看出，兩個(gè)測(cè)試時(shí)間點(diǎn)大鼠牙槽骨骨體積分?jǐn)?shù)、骨小梁數(shù)量硬食組均較軟食組同時(shí)上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；骨小梁分離度硬食組較軟食組降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；軟食組4月結(jié)果與2月結(jié)果相比，骨體積分?jǐn)?shù)降低，骨小梁分離度升高；硬食組4月結(jié)果與2月結(jié)果相比，骨體積分?jǐn)?shù)降低，骨小梁分離度升高。

表1 喂食2個(gè)月大鼠下頜骨顯微CT檢測(cè)結(jié)果

表2 喂食4個(gè)月大鼠下頜骨顯微CT檢測(cè)結(jié)果

2.2 IGF-1、OPG和RANKL蛋白表達(dá)

表3和表4是分別是下頜骨第三磨牙區(qū)IGF-1、OPG和RANKL蛋白2月、4月表達(dá)檢測(cè)結(jié)果。從結(jié)果可以看出，兩個(gè)測(cè)試時(shí)間點(diǎn)大鼠牙槽骨中IGF-1和OPG表達(dá)硬食組均較軟食組同時(shí)上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），兩種蛋白濃度呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.884；RANKL表達(dá)硬食組較軟食組降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；IGF-1和RANKL兩種蛋白濃度呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.913；軟食組4月結(jié)果與2月結(jié)果相比，IGF-1蛋白表達(dá)升高，不顯著（P＞0.05）；OPG蛋白表達(dá)降低，不顯著（P＞0.05）；RANKL蛋白表達(dá)降低，不顯著（P＞0.05）；硬食組4月結(jié)果與2月結(jié)果相比，IGF-1蛋白表達(dá)升高，不顯著（P＞0.05）；OPG蛋白表達(dá)降低，不顯著（P＞0.05）；RANKL蛋白表達(dá)升高，不顯著（P＞0.05）。

表3 喂養(yǎng)2個(gè)月IGF-1/OPG/RANKL蛋白檢測(cè)結(jié)果（X±S）

表4 喂養(yǎng)4個(gè)月IGF-1/OPG/RANKL蛋白檢測(cè)結(jié)果（X±S）

3 討論

骨組織有適應(yīng)力學(xué)環(huán)境的能力，稱(chēng)為骨的力學(xué)適應(yīng)性。骨組織能夠順應(yīng)力學(xué)環(huán)境的變化進(jìn)行骨量的調(diào)整，適度的力學(xué)刺激能夠促進(jìn)骨的生長(zhǎng)，增加骨量。骨體積分?jǐn)?shù)、骨小梁寬度、骨小梁數(shù)量、骨小梁分離度是重要的骨形態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn)較強(qiáng)的力學(xué)刺激能夠促進(jìn)牙槽骨的生長(zhǎng)[22-23]，骨體積分?jǐn)?shù)、骨小梁數(shù)量增加，骨小梁分離度降低。本研究亦證實(shí)這一點(diǎn)。

骨的力學(xué)適應(yīng)性過(guò)程主要分為3個(gè)環(huán)節(jié)：宏觀(guān)學(xué)力信號(hào)轉(zhuǎn)化為微觀(guān)力學(xué)信號(hào)；微觀(guān)力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)化為生化信號(hào)；生化信號(hào)傳遞到傳感細(xì)胞。力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)化為生化信號(hào)是關(guān)鍵環(huán)節(jié)。頜骨承受牙齒傳遞的咀嚼載荷，骨重建活躍。骨重建受到多種生化分子系統(tǒng)的調(diào)節(jié)。研究表明，IGF-1、OPG/RANKL均為應(yīng)力敏感的分子系統(tǒng)[7-12]。

IGF-1是骨組織中的一種局部效應(yīng)分子，能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖與分化，對(duì)骨的生長(zhǎng)發(fā)育具有調(diào)節(jié)作用[10,21]。研究發(fā)現(xiàn)在肌肉和骨骼中IGF-1的表達(dá)會(huì)受到應(yīng)力的調(diào)控[11]。鮮成玉等體外實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了拉伸力學(xué)刺激能夠促進(jìn)IGF-1的表達(dá)，認(rèn)為IGF-1是受應(yīng)力調(diào)控的敏感因子。本研究結(jié)果顯示，SD大鼠牙槽骨中硬食組IGF-1蛋白表達(dá)量高于軟食組，說(shuō)明高咀嚼力刺激能夠促進(jìn)牙槽骨中IGF-1的表達(dá)。這表明，不論體外還是體內(nèi)，力學(xué)刺激均能促進(jìn)IGF-1的表達(dá)，更證實(shí)了IGF-1為應(yīng)力敏感因子。

OPG-RANKL-RANK是調(diào)節(jié)骨重建的關(guān)鍵信號(hào)通路[13-15]，成骨細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞分泌OPG 和RANKL；RANKL與破骨細(xì)胞前體細(xì)胞和破骨細(xì)胞表面的RANK 結(jié)合后，將信號(hào)傳入細(xì)胞內(nèi)，刺激破骨細(xì)胞的形成和成熟，促進(jìn)骨吸收；OPG與RANKL競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，減少了RANKL同RANK的結(jié)合，抑制破骨細(xì)胞分化成熟。從而競(jìng)爭(zhēng)性減少了RANKL同RANK 的結(jié)合，阻斷骨吸收信號(hào)傳遞，抑制破骨細(xì)胞分化成熟，抑制骨吸收；骨組織局部微環(huán)境中的OPG、RANKL或RANK表達(dá)水平，可能是決定破骨或成骨平衡的關(guān)鍵。很多研究證實(shí)，力學(xué)刺激能夠調(diào)節(jié)OPG、RANKL的表達(dá)[15-19]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SD大鼠牙槽骨中硬食組OPG蛋白表達(dá)量高于軟食組，硬食組RANKL蛋白表達(dá)量低于軟食組。這表明，咀嚼力對(duì)OPG/RANKL蛋白表達(dá)有影響，可以調(diào)控OPG/RANK/RANKL信號(hào)通路。

有研究認(rèn)為，OPG/RANKL/RANK是參與骨重建的關(guān)鍵分子信號(hào)系統(tǒng)，體內(nèi)諸多激素和因子可通過(guò)影響OPG或RANKL的表達(dá)來(lái)影響骨重建，將不同因素的影響轉(zhuǎn)化為適當(dāng)?shù)腞ANKL和OPG產(chǎn)出，從而對(duì)骨重建進(jìn)行調(diào)控[11]。骨重建的平衡受多條信號(hào)通路調(diào)控，各條通路之間協(xié)同作用，互相影響[20-21]。本研究顯示，大鼠牙槽骨中IGF-1和OPG兩種蛋白濃度呈正相關(guān)；IGF-1和RANKL兩種蛋白濃度呈負(fù)相關(guān)，證實(shí)了不同信號(hào)通路之間的關(guān)聯(lián)性。

本研究硬食組4月結(jié)果與2月結(jié)果相比，IGF-1蛋白表達(dá)升高；OPG蛋白表達(dá)降低，RANKL蛋白表達(dá)升高，IGF-1還未達(dá)到峰值，OPG/RANKL已達(dá)到峰值，開(kāi)始向相反方向回調(diào)。這表明，IGF-1與OPG/RANKL對(duì)力學(xué)刺激的響應(yīng)或許有差異。有研究認(rèn)為[20]，力學(xué)刺激強(qiáng)度、頻率和持續(xù)時(shí)間均可能是影響OPG、RNAKL表達(dá)的重要因素，即適宜的力學(xué)刺激提高OPG表達(dá)抑制RANKL 表達(dá)，促進(jìn)成骨作用；而過(guò)度力學(xué)刺激則會(huì)抑制OPG表達(dá)，提高RANKL表達(dá)。本研究或許從這里可以得到解釋。

本文研究了不同咀嚼力對(duì)青齡期SD大鼠牙槽骨IGF-1、OPG和RANKL蛋白表達(dá)的影響并研究了它們之間的關(guān)系，探討了咀嚼力在牙槽骨骨重建中的傳遞，有助于揭示牙槽骨骨重建的力學(xué)適應(yīng)性機(jī)制，為生物力學(xué)方法防治頜骨骨代謝相關(guān)疾病提供理論指導(dǎo)。骨重建除受到IGF-1、OPG/RANKL信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，還有其它信號(hào)通路，它們對(duì)力學(xué)刺激強(qiáng)度、頻率和持續(xù)時(shí)間的響應(yīng)是否一致，它們之間的協(xié)同作用是怎樣的如何產(chǎn)生的，是否有信號(hào)通路起主導(dǎo)作用，還需進(jìn)一步的研究。