枯草芽孢桿菌在斷奶仔兔生長(zhǎng)和預(yù)防腹瀉中的應(yīng)用研究

薛 云，周 鋒，王樂偉

（河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)與工程學(xué)院，河南洛陽 471023）

斷奶期仔兔對(duì)環(huán)境和食物的變化較為敏感，易出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致生長(zhǎng)速度放緩，生理性和病理性腹瀉發(fā)生，嚴(yán)重時(shí)可以引起仔兔死亡，給家兔養(yǎng)殖業(yè)造成巨大損失（潘海強(qiáng)，2018）。斷奶仔兔機(jī)體發(fā)育尚不完善，尤其是胃腸道黏膜較脆弱，機(jī)體對(duì)食物的消化吸收能力低，因此，當(dāng)仔兔食物從母乳變成飼料時(shí)，常導(dǎo)致消化不良，繼而出現(xiàn)腹瀉等疫病（高媛媛等，2011）。也有學(xué)者認(rèn)為，仔兔斷奶之后不能再從母乳中獲得免疫球蛋白，而自身體內(nèi)的母源抗體水平也迅速下降，因此，感染輪狀病毒等病原微生物的幾率增加，導(dǎo)致仔兔群體腹瀉（Pan等，2014）。此外，在家兔實(shí)際養(yǎng)殖生產(chǎn)中，抗生素使用不當(dāng)常引起腸道微生物菌群失衡，加劇仔兔腹瀉病情的發(fā)展，給斷奶仔兔的飼養(yǎng)管理帶來困擾（Yuan等，2012）。

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis，BS）作為一種重要的微生態(tài)制劑已被廣泛應(yīng)用于營養(yǎng)性飼料領(lǐng)域，其無毒、無殘留，同時(shí)又耐熱、耐酸、耐堿和耐紫外線等多種環(huán)境不利因素，是一種穩(wěn)定、實(shí)用又有效的營養(yǎng)性飼料添加劑（Bae等，2010）。一些證據(jù)顯示，枯草芽孢桿菌可提高畜禽飼料利用率，提高生產(chǎn)性能，增強(qiáng)機(jī)體免疫力，提高動(dòng)物機(jī)體抗病能力（龍淼等，2015）。枯草芽孢桿菌作為一種綠色添加劑，已應(yīng)用于豬、禽、牛等反芻動(dòng)物和魚類等水產(chǎn)動(dòng)物，但在家兔養(yǎng)殖方面的應(yīng)用研究仍相對(duì)較少（Joyeux等，1960）。因此，本試驗(yàn)旨在研究枯草芽孢桿菌對(duì)斷奶期仔兔生長(zhǎng)性能的促進(jìn)作用，并分析在環(huán)境、飼料等因素改變所造成的應(yīng)激性、病理性腹瀉下其對(duì)仔兔的保護(hù)作用，為枯草芽孢桿菌在家兔養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株 某企業(yè)生產(chǎn)枯草芽孢桿菌制劑，有效成分為枯草芽孢桿菌，輔料為淀粉。其中，枯草芽孢桿菌活菌計(jì)數(shù)＞2×1010cfu/g。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 健康斷奶仔兔40只，雌性，日齡（35±3）d，體重（2±0.3）kg，購自某肉兔養(yǎng)殖場(chǎng)。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物分組和飼喂方法 將40只斷奶仔兔隨機(jī)分為4組，每組10只。其中A、B、C組為試驗(yàn)組，基礎(chǔ)日糧中分別添加0.1%、0.2%、0.3%的枯草芽孢桿菌制劑。D為對(duì)照組，基礎(chǔ)日糧中不添加枯草芽孢桿菌制劑。基礎(chǔ)日糧的配方參照任永軍等（2014）方法進(jìn)行配制，各組仔兔均按養(yǎng)殖場(chǎng)的正常頻率和飼喂量連續(xù)飼喂30 d。

1.4 生長(zhǎng)性能測(cè)定 對(duì)試驗(yàn)第0和30天的各組仔兔分別稱量空腹體重，計(jì)算仔兔平均日增重，記錄各組仔兔飼料的加料量與剩余量，計(jì)算料重比，計(jì)算公式如下：

1.5 免疫指標(biāo)測(cè)定 對(duì)試驗(yàn)第0和第30天各組仔兔分別經(jīng)耳中動(dòng)脈無菌采血1 mL。4℃冰箱靜置2 h后，3000 r/min離心10 min，收集血清。然后經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測(cè)定兔血清中總IgA、IgM、IgG含量以及補(bǔ)體C3和補(bǔ)體C4水平。

1.6 免疫器官指數(shù)測(cè)定 試驗(yàn)結(jié)束后，各組隨機(jī)挑選3只仔兔，頸部脫臼處死，采集脾臟和胸腺稱重，測(cè)定免疫器官指數(shù)。免疫器官指數(shù)計(jì)算公式為：

脾（胸腺）指數(shù)（g/kg）=脾（胸腺）質(zhì)量 /宰前活質(zhì)量。

1.7 腹瀉率與死亡率測(cè)定 從試驗(yàn)開始至30 d試驗(yàn)結(jié)束，每天觀察仔兔的精神狀態(tài)、活動(dòng)情況和排便情況，重點(diǎn)記錄各組仔兔腹瀉與死亡情況。試驗(yàn)結(jié)束后，統(tǒng)計(jì)各組仔兔腹瀉發(fā)生的發(fā)病率和死亡率。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 12.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)以百分率（%）表示，計(jì)量數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)之間的比較采用Fisher精確檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 平均日增重和料重比測(cè)定 由表1可知，各組仔兔平均日增重測(cè)定結(jié)果表明，基礎(chǔ)日糧添加了枯草芽孢桿菌制劑的試驗(yàn)組A、B、C組仔兔平均日增重均顯著高于無添加對(duì)照組D組（P＜0.05）。其中，B組和C組仔兔平均日增重與對(duì)照組D組相比差異極顯著（P＜0.01）。A、B、C三組間仔兔平均日增重?zé)o顯著差異（P＞0.05）。各組仔兔料重比測(cè)定結(jié)果表明，B組料重比顯著低于對(duì)照組D組（P＜0.05），其他組間無顯著差異（P ＞ 0.05）。

表1 枯草芽孢桿菌對(duì)仔兔平均日增重和料重比的影響

2.2 免疫指標(biāo)測(cè)定 由表2可知，各組仔兔血清免疫指標(biāo)測(cè)定結(jié)果表明，在IgA、IgM、IgG、C3和C4 5個(gè)檢測(cè)指標(biāo)中，B組和C組IgA、IgG水平與D組存在顯著差異（P＜0.05）。而A、B、C試驗(yàn)組其他指標(biāo)與對(duì)照組D組相比，雖略有升高但差異均不顯著（P＞0.05）。

表2 各組仔兔血清免疫指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

2.3 免疫器官指數(shù)測(cè)定 由表3可知，免疫器官指數(shù)測(cè)定結(jié)果表明，C組仔兔的胸腺重量顯著高于對(duì)照組D組（P＜0.05），其他組間均無顯著差異（P＞0.05）。C組的脾臟和胸腺免疫器官指數(shù)均最高，但與其他各組差異不顯著（P＞0.05）（表3）。

表3 各組仔兔免疫器官指數(shù)測(cè)定結(jié)果

2.4 腹瀉率及死亡率的測(cè)定 由表4可知，試驗(yàn)開始后，跟蹤觀察統(tǒng)計(jì)斷奶仔兔的健康狀況發(fā)現(xiàn)，基礎(chǔ)日糧添加了枯草芽孢桿菌制劑的試驗(yàn)組均無死亡現(xiàn)象，僅A組1只仔兔出現(xiàn)輕微腹瀉癥狀。而對(duì)照組D組中，1只仔兔死亡，2只出現(xiàn)嚴(yán)重腹瀉癥狀。各試驗(yàn)組仔兔的腹瀉率和死亡率均顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。其中，B組和C組的仔兔的腹瀉率均顯著低于A組（P＜0.05）。

表4 腹瀉率及死亡率統(tǒng)計(jì)結(jié)果

3 討論

枯草芽孢桿菌是在人和動(dòng)物營養(yǎng)領(lǐng)域得到普遍認(rèn)可的一種腸道益生菌，具有耐高溫、耐酸堿、性質(zhì)穩(wěn)定等優(yōu)勢(shì)，常用于食品添加劑（Yu等，2009；Hong等，2008）。枯草芽孢桿菌可以產(chǎn)生蛋白酶和脂肪酶等多種酶類，提高機(jī)體對(duì)營養(yǎng)物的消化吸收能力（Liu等，2006）。同時(shí)還可以輔助動(dòng)物消化道微生物健康菌群的建立，促進(jìn)機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育（Vepachedu等，2005；Imai等，2000）。由于斷奶仔兔消化道功能不完善，對(duì)飼料的消化吸收能力有限（胡艷等，2013；張佳蕾等，2017），而枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的多種酶類和多糖能幫助機(jī)體消化吸收食物，從而促進(jìn)兔的生長(zhǎng)發(fā)育和提高其抗病能力（Guo等，2017；Phuoc等，2017）。因此，推測(cè)在仔兔斷奶敏感期可以起到較好的促生長(zhǎng)作用，同時(shí)具有預(yù)防腹瀉的作用。

動(dòng)物日增重和料重比反應(yīng)了動(dòng)物對(duì)飼料的利用率，是評(píng)價(jià)生長(zhǎng)性能的主要指標(biāo)。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)向斷奶仔兔基礎(chǔ)日糧中添加適量枯草芽孢桿菌制劑能有效提高日增重和降低料重比，改善仔兔生長(zhǎng)性能。血清免疫指標(biāo)和免疫器官重量是評(píng)價(jià)健康動(dòng)物機(jī)體免疫系統(tǒng)發(fā)育的重要參考依據(jù)。在本研究中，血清免疫指標(biāo)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，添加適量枯草芽孢桿菌制劑的試驗(yàn)組IgA、IgG水平與對(duì)照組存在顯著差異。免疫器官指數(shù)測(cè)定結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，部分試驗(yàn)組胸腺重量顯著高于對(duì)照組。這結(jié)果表明，基礎(chǔ)日糧中添加適量枯草芽孢桿菌制劑既有助于仔兔免疫系統(tǒng)的生長(zhǎng)發(fā)育，也間接起到防病抗病的作用。此外，對(duì)于試驗(yàn)仔兔的跟蹤觀察發(fā)現(xiàn)，添加適量枯草芽孢桿菌制劑的試驗(yàn)組其腹瀉率和死亡率均顯著低于對(duì)照組，也進(jìn)一步證實(shí)了我們的推測(cè)，枯草芽孢桿菌可以有效預(yù)防斷奶仔兔腹瀉的發(fā)生。

在本研究中，枯草芽孢桿菌添加還呈現(xiàn)出一定的劑量效應(yīng)。對(duì)比各試驗(yàn)組添加0.1%、0.2%、0.3%枯草芽孢桿菌制劑的效果，0.2%枯草芽孢桿菌制劑在提高斷奶仔兔的生長(zhǎng)性能和抗腹瀉能力的綜合效應(yīng)最佳，可以作為家兔生產(chǎn)養(yǎng)殖中推薦使用的添加劑量。

4 結(jié)論

在斷奶仔兔基礎(chǔ)日糧中添加適量的枯草芽孢桿菌制劑可以有效增加仔兔平均日增重，降低料重比，完善仔兔生長(zhǎng)發(fā)育和免疫系統(tǒng)，降低腹瀉發(fā)病率和死亡率。添加0.2%的枯草芽孢桿菌制劑是綜合評(píng)價(jià)效用最佳的使用劑量。