uc.12+A及其宿主基因SFPQ在小鼠B淋巴瘤細胞中的表達研究

長鏈非編碼RNA(lncRNA)是長達200個核苷酸以上的RNA轉錄本,它們不編碼任何蛋白質[1]。超保守區(qū)域(ultraconserved regions, UCRs)是存在于基因組中一些DNA序列,在不同物種之間高度保守[2],目前已發(fā)現(xiàn)有481個>200 bp的基因片段均屬于超保守區(qū)域。在這些超保守區(qū)域中部分可以轉錄,它們的轉錄產物叫做T-UCRs(transcribed ultraconserved regions,T-UCRs)[3],屬于lncRNA。超保守區(qū)域通常位于癌基因相關的脆弱位點,有文章報道T-UCRs的表達水平在人類的膀胱癌[4]、肝癌[5]、結腸癌[6]、神經母細胞瘤[7]等多類腫瘤中均發(fā)生顯著改變,這些表達水平發(fā)生變化的T-UCRs是否具有生物學功能是人們迫切要知道的。近幾年來越來越多的證據(jù)表明，T-UCRs在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起著至關重要的作用[8]。

脯氨酸/谷氨酰胺富含性剪接因子(splicing factor proline and glutamine rich,SFPQ)是在脊椎動物體內廣泛表達的核蛋白[9],它在調控哺乳動物的晝夜節(jié)律方面發(fā)揮重要作用[10]。同時也是體內重要的抑癌蛋白, SFPQ可通過下調泛素樣蛋白LC3B來增強結腸癌細胞的凋亡[11]。也有文獻報道,它與lncRNA NEAT-1結合調控體內免疫應答[12];與肺癌轉移相關轉錄本1(MALAT1)結合,上調多嘧啶串結合蛋白2(PTBP2)的表達水平,從而促進直腸癌腫瘤生長與轉移[13]。在小鼠體內,SFPQ通過與非編碼RNA Vl30特異性結合來調控下游基因的表達水平[14]。人SFPQ基因位于1號染色體上,全長9533 bp,鼠的SFPQ基因位于4號染色體,全長9935 bp。兩者均由10個外顯子和9個內含子構成,在該基因的第9號外顯子和第10號外顯子之間的內含子中,有一段超保守序列,編碼產物為uc.12+A。關于uc.12+A是否具有生物學功能及其與SFPQ之間是否具有調控作用目前尚無相關文獻報道。

由于uc12+A是轉錄自SFPQ基因的反義鏈,因此本文擬采用鏈特異性逆轉錄聚合酶鏈式反應(strand-specific RT-PCR)的實驗方法檢測uc.12+A在B淋巴瘤細胞中的表達,同時用實時熒光定量PCR及Western Blot技術檢測SFPQ在B淋巴瘤細胞中的表達情況,以了解兩者在B細胞淋巴瘤中表達的相關性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞培養(yǎng):小鼠B細胞淋巴瘤細胞株(38B9和myc3)由本實驗室提供。分別用DMEMF-12培養(yǎng)基,α-MEM培養(yǎng)基加10%胎牛血清、1%青-鏈霉素,在37 ℃,5%CO2條件下培養(yǎng)。利用CD19磁珠抗體從小鼠脾臟中分選正常B細胞。

1.1.2 試劑與儀器設備: TRIzol(Invitrogen公司);三氯甲烷、異丙醇(中國恒利試劑化學試劑公司); DEPC(上海生物工程有限公司);無水乙醇(國藥集團化學試劑有限公司);逆轉錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒(TakaRa公司)。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。SFPQ抗體(Millipore,美國); GAPDH 抗體(Vazyme,中國);SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(碧云天,中國);冷凍離心機(Thermo,美國);細胞培養(yǎng)箱(Thermo,美國);核酸蛋白定量儀(Eppendorf,美國);凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司);實時熒光定量PCR儀(ABI,美國)。

1.2 方法

1.2.1 引物設計:在ucbase、pubmed數(shù)據(jù)庫中分別查出uc.12+A、小鼠SFPQ的基因序列,設計鏈特異性逆轉錄引物和定量PCR引物。見表1，2。

表1 鏈特異性逆轉錄引物

表2 實時熒光定量PCR引物

1.2.2 strand-specific RT-PCR檢測uc.12+A、SFPQ表達。

1.2.2.1 sfrand-specific RT-PCR:使用Takara逆轉錄試劑盒進行逆轉錄反應,嚴格按照說明書進行實驗,取1μg 38B9和myc3的總RNA分別加入0.2 mL離心管中,進行去除基因組DNA純化。隨后使用鏈特異性引物進行逆轉錄反應。37 ℃逆轉錄15 min,85 ℃滅活5 s,待降溫至4 ℃時取出,用RNase free H2O五倍稀釋,-20 ℃冰箱保存。

1.2.2.2 實時熒光定量PCR:取稀釋后的cDNA 2μL,SYBRⅡ10μl,上游引物和下游引物各0.5μL,Rox 0.4μL,RNase free H2O 6μL加入8連管,每個樣本加3個復孔,混勻, 用ABI7500實時熒光定量PCR儀檢測樣本。反應條件:第一步:95 ℃;第二步:95 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s,40個循環(huán);第三步:95 ℃ 15 s,55 ℃ 30 s,95 ℃ 30s。

1.2.3 Western Blot 檢測SFPQ表達:收取細胞,加入蛋白裂解液(含磷酸酶抑制劑、蛋白酶抑制劑)提取蛋白,用BCA法進行蛋白定量,按每孔40μg蛋白上樣進行SDS-PAGE凝膠電泳,濃縮膠濃度為5%,分離膠濃度為10%。采用濕轉的方法將蛋白轉至PVDF膜上,5%BSA室溫封閉2 h,加SFPQ抗體(稀釋濃度1∶1000),4 ℃孵育過夜, 二抗室溫孵育1 h(稀釋濃度為1∶10000),使用化學發(fā)光成像分析儀顯影成像。

1.3 統(tǒng)計學分析 所得數(shù)據(jù)使用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示。數(shù)據(jù)分析采用獨立樣本t檢驗及Spearson相關性分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 uc.12+A在小鼠B淋巴瘤細胞中的表達 使用鏈特異性引物時,uc.12+A的表達比用普通的隨機引物低,兩種檢測方法中uc.12+A在B淋巴瘤細胞中的表達均高于正常B細胞,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),見圖1。

2.2 SFPQ在小鼠B淋巴瘤細胞中的表達

2.2.1 SFPQ基因表達水平:SFPQ在小鼠B淋巴瘤細胞中的表達明顯升高,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖2。

2.2.2 SFPQ蛋白表達水平:SFPQ在B淋巴瘤細胞株中蛋白水平明顯高于正常B細胞,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖3。

2.3 uc.12+A與SFPQ在B淋巴瘤細胞中表達的相關性 分析統(tǒng)計結果顯示兩者呈顯著正相關(R2=0.8354)。

注:**P<0.01;A:普通RT-PCR;B:strand-specific RT-PCR圖1 實時定量PCR檢測uc.12+A在B淋巴瘤細胞中的表達

注:**P<0.01圖2 普通RT-PCR檢測SFPQ在B淋巴瘤細胞中的表達

注:*P<0.05;A:western blot 電泳圖; B:灰度值分析統(tǒng)計圖圖3 Western blot 檢測SFPQ蛋白在B淋巴瘤細胞中的表達

3 討論

lncRNA不編碼蛋白質,但會表現(xiàn)出類似mRNA的結構特征,例如外顯子基因結構和poly(A)尾巴，具有組織學和發(fā)育學特異性的表達模式。

到目前為止已經發(fā)現(xiàn)很多種在癌組織中表達出現(xiàn)異常的T-UCRs,其對腫瘤的發(fā)生發(fā)展起著至關重要的作用。然而超保守RNA有的在正義鏈上表達,有的在反義鏈上表達,使用傳統(tǒng)的RT-PCR方法時,反轉錄體系中的所有RNA都充當了cDNA的第一鏈模板,無法準確檢測出正義鏈或反義鏈上的T-UCR的表達情況。針對這個問題,我們用與T-UCR互補序列的寡核苷酸作為特異性逆轉錄引物,取代隨機六聚體引物進行RT-PCR,只產生所需要的cDNA,從而產生更為特異性的PCR擴增。實驗結果顯示，來自反義鏈的uc.12+A在B淋巴瘤細胞株中,sfrand-pecific RT-PCR組表達比普通RT-PCR組低,但在這2種實驗方法中uc.12+A在38B9和myc3中表達增高的總趨勢沒有改變。本研究提示,與普通的RT-PCR相比,sfrand-pecific RT-PCR能更精確地檢測T-UCRs的表達情況,為檢測T-UCRs表達提供新方法。

SFPQ作為一種抑癌蛋白,已涉及無數(shù)核功能,包括DNA修復、轉錄調控、剪接和RNA轉運[15],可與dsDNA在許多基因的啟動子上相互作用,從而發(fā)揮著控制轉錄調控的功能。它也是DNA雙鏈斷裂修復通路的重要參與者,直接與DNA以及DNA修復蛋白結合[16-17],并且迅速定位于細胞內的DNA損傷部位[23],有數(shù)篇文獻報道SFPQ與lncRNA結合,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要功能。而uc.12+A位于SFPQ蛋白編碼基因的內含子上,本研究首先通過sfrand-pecific RT-PCR的方法檢測發(fā)現(xiàn)uc.12+A在B淋巴瘤細胞中表達升高,隨后進一步檢測其宿主基因SFPQ在同種淋巴瘤細胞株中的表達情況,發(fā)現(xiàn)SFPQ的表達趨勢無論在mRNA水平還是蛋白水平上都與uc.12+A一致。初步研究結果表明,uc.12+A與其宿主基因SFPQ在B細胞淋巴瘤中的表達水平均呈現(xiàn)增高的特點,且具有一定相關性,兩者之間的是否具有相互調控作用以及其對B細胞淋巴瘤的發(fā)生發(fā)展的影響有待進一步研究。