煙霧暴露對大鼠肺血管重塑及TLR-4表達的影響

吸煙是一種嚴重的社會危害,是慢性支氣管炎的重要致病因素,且近年來研究表明,煙霧不僅可導致氣管、支氣管的損害,而且可直接作用于肺血管,引起肺血管平滑肌異常增殖及血管內皮細胞遷移,導致肺血管重塑[1]。肺血管重塑是肺動脈高壓的病理基礎,其本質是血管的慢性炎癥反應,也是疾病從慢性支管炎發展至肺心病、呼吸衰竭的重要病理過程[2]。Toll樣受體4(TLR-4)是一種天然免疫和被動免疫的分子,通過與受體結合后激發大量炎癥因子的釋放而參與急性或慢性炎癥反應。已有研究表明TLR-4在肺血管內皮細胞及平滑肌細胞均有表達,TLR-4/NF-κB信號通路可能促進血管重塑[3]。為探討TLR-4與肺血管重塑的相關性,本研究制備煙霧暴露大鼠模型,觀察不同煙霧暴露量下大鼠肺部病理形態學和肺血管的變化及TLR-4蛋白、肺血管平滑肌增殖細胞核抗原(PCNA)蛋白的改變,探討肺血管TLR-4的表達與肺血管重塑的關系,為吸煙后肺血管重塑的可能機制提供基礎實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 清潔級健康雄性3月齡SD大鼠40只,體質量約180～200 g(由華中科技大學同濟醫學院附屬梨園醫院老年醫學研究所動物實驗室飼養);CY-100B數字測氧儀,兔抗TLR-4多克隆抗體、小鼠抗PCNA單克隆抗體、PV600免疫試劑盒(均購自武漢谷歌生物公司);奧林巴斯光學顯微鏡(日本奧林巴斯公司);HMIAS-2000彩色圖文分析系統(武漢千屏影像公司)。

1.2 實驗模型制備及動物分組 SD大鼠隨機分為:對照組(S1組),煙霧暴露4周組(S2組),煙霧暴露8周組(S3組),煙霧暴露12周組(S4組),每組各10只。對照組大鼠置于小鐵籠內,除常規喂養外不做其他處理;煙霧暴露大鼠在各組規定煙霧暴露時間內放置于大小為100 cm×65 cm×45 cm的煙熏箱中,香煙每次10支,捆扎后點燃置于煙熏箱中的置物架上,煙熏箱中的氧濃度保持在20%～21%之間,用CY-100B數字測氧儀進行監測,根據監測結果開放煙熏箱的通氣孔。實驗組大鼠每天煙霧暴露2次,2次暴露時間間隔>4 h。

1.3 病理標本制作 各組大鼠到達造模時間干預點后,用1﹪戊巴比妥鈉(90 mg/kg)麻醉實驗動物,放血處死后開胸,用 4%多聚甲醛經氣管充分灌注直至胸膜,剪下右主支氣管,置于4%的中性甲醛中固定,取材、脫水,制成約4μm的石蠟切片,用于HE染色和免疫組化。

1.4 肺血管HE染色及病理學觀察 選取厚度約在4μm左右的病理切片,用蘇木精-伊紅法染色,在光學顯微鏡下觀察各組大鼠肺泡和肺血管的病理學情況,每張切片隨機選取結構較完整、橫斷面較圓且直徑約為50～200μm的肺動脈5支,用HMIAS-2000型彩色圖文分析儀進行測量,測量血管的內徑、外徑,計算出血管壁厚度、血管壁面積及血管總面積,并計算管壁面積/血管總面積比值(WA%),血管壁厚度/血管外徑比值(WT%)。

1.5 肺動脈TLR-4蛋白、PCNA蛋白的表達 采用PV6000二步法免疫組化染色法,選取厚度約4μm的病理切片,常規脫蠟水化,檸檬酸鈉抗原修復,再用3%過氧化氫室溫孵育5～10 min,分別加兔抗TLR-4多克隆抗體、小鼠抗PCNA單克隆抗體,4 ℃過夜,后加顯色試劑顯色,整個過程嚴格按照試劑盒說明書進行操作。在200倍視野下隨機選取每張切片上5條直徑約在100～200μm動脈,采集圖像,用HMIAS-2000彩色圖文分析系統,測定每個視野下陽性染色動脈的陽性細胞率,計算出TLR-4及PCNA的平均積分吸光度(IA)。肺動脈陽性染色的判斷標準:肺動脈壁上出現棕黃色顆粒。以上操作嚴格按照說明書進行。

2 結果

2.1 HE染色結果 S1組肺泡排列較規則,肺泡及肺間質結構基本正常,肺動脈管壁薄且光滑,血管平滑肌排列均勻,較少增生,管壁及管腔周圍有較少炎性細胞浸潤。煙霧暴露組大鼠肺泡組織結構都有不同程度破壞,符合慢性支氣管炎改變:肺泡結構紊亂,肺泡壁變薄或斷裂,部分有融合。S2組肺動脈血管內皮細胞及平滑肌細胞輕度增生,管壁欠光滑,管壁及周圍有少許炎性細胞浸潤,S4組肺動脈血管內皮細胞及平滑肌細胞增生肥大,中膜層增厚,管腔狹窄,管壁及周圍可見較多炎性細胞浸潤(主要是單核細胞、淋巴細胞、中性粒細胞等),S3組肺動脈改變介于S2及S4組之間。見圖1。4組的WA%及WT%隨暴露時間的增長而不斷升高，且各組間差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

圖1 各組大鼠肺動脈病理(HE染色,×200倍)

2.2 各組肺動脈TLR-4蛋白、PCNA蛋白的表達 TLR-4胞質呈棕黃色顆粒為陽性表達,PCNA胞核呈棕黃色顆粒為陽性表達。S1組肺動脈較少陽性染色,而隨著煙霧暴露時間增加,S2、S3、S4組肺動脈染色逐漸加深。見圖2,3。

4組間,TLR-4蛋白、PCNA蛋白表達水平均隨煙霧暴露時間延長而增高,且各組間差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠肺血管WA% 、WT% 、TLR4、PCNA表達結果

注：與S1組比較,*P<0.05；與S2組比較,△P<0.05;與S3組比較,▲P<0.05

圖2 各組大鼠肺動脈TLR-4免疫組化染色結果(×200倍)

圖3 各組大鼠肺動脈PCNA免疫組化染色結果(×200倍)

2.3 相關性分析 TLR-4蛋白表達量與WA%、WT%、PCNA均呈正相關(r=0.815、0.769、0.713,P均<0.01)。

3 討論

煙霧刺激、大氣污染、細菌感染等是慢性支氣管炎的重要發病因素。有研究提出煙霧可通過氧化應激反應、炎癥反應及血管內皮生長因子(VEGF)、基質金屬酶等血管活性介質調節來介導肺泡和肺血管損傷,導致氣管及血管重塑,從而引起其結構和功能發生改變,誘發慢性支氣管炎、肺心病等疾病的發生[4]。本實驗制備煙霧暴露模型,HE染色提示煙霧暴露組大鼠肺泡結構較對照組紊亂,血管壁周圍出現炎性細胞,血管平滑肌出現不同程度增生,血管壁增厚或管腔變形,以吸煙12周組改變最為明顯。煙霧暴露組大鼠肺部改變提示煙霧暴露導致慢性支氣管炎的發生,且引起血管重塑,這與文獻報道是相符合的[5-6]。流行病學提示煙霧中的一氧化碳(CO)、尼古丁、含硫化合物等有害氣體及有毒顆粒是多種呼吸道疾病的誘因,也是動脈硬化、高血壓、肺心病的致病因素,但煙霧致肺血管重塑機制不甚明確。本研究中煙霧暴露組大鼠WA%、WT%水平較對照組明顯增高,表明肺血管重塑程度隨煙霧暴露時間延長而加重。

近年來研究發現,免疫應答可啟動炎癥介質釋放,促使血管平滑肌增生及新生血管形成,加劇血管重塑,TOLL家族在其中發揮了重要作用[7]。TLR-4是近年來發現的與肺部疾病關系密切的新型免疫分子。國內外研究成果提示TLR-4存在于氣道上皮細胞、平滑肌細胞、單核巨噬細胞及血管內皮細胞等,且主要表達于細胞基底膜,其最主要生物學功能就是引發炎癥反應[8]。核因子(NF)-κB作為TLR-4下游最為重要的轉錄基因,煙霧、細菌脂多糖、感染等外界刺激到達后,激活TLR-4/NF-κB信號通路,引起相應免疫基因的活化,誘導白介素-1(IL-1)、IL-6等前炎癥因子,LTB-4、C5a等趨化因子及血小板源生長因子等的分泌和釋放[9]。目前已有研究證實，TLR-4參與氣道重塑及氣道高反應性的調節,影響氣道黏液的高分泌,而且在血管重塑中發揮主導作用[10]。

TLR-4參與血管慢性炎癥反應以及血管重塑早有報道。有文獻報道TLR-4影響小鼠胸主動脈的血管內皮素、細胞間黏附分子-1、α-平滑肌肌動蛋白等細胞因子的分泌,加重血管肌化程度,誘導高血壓小鼠的血管重塑,且可能機制是通過TLR-4/NF-κB信號活化后實現的[11];伏俊等[12]發現慢性阻塞性肺疾病病人的肺血管重塑與煙霧刺激后TLR-4水平增高,過氧化物酶增殖體激活受體γ(PPAR-γ)等炎癥因子釋放增加而引起血管平滑肌增殖有關。本實驗免疫組化結果提示:煙霧暴露組TLR-4表達量、PCNA表達量都顯著高于對照組,且隨煙霧暴露時間延長,它們在肺血管中的表達量均呈時間依賴性增高,且兩者之間亦呈正相關。由此我們推測煙霧暴露可提升TLR-4表達,TLR-4可能參與肺血管重塑,其機制可能與誘導平滑肌細胞增殖有關。同時，各組大鼠肺血管TLR-4水平與WA%、WT%均呈正相關,表明TLR-4表達與肺血管重塑程度呈正相關。而Lee等[13]發現煙霧可以激活TLR-4在肺泡上皮細胞及血管內皮細胞中的表達并誘導其信號轉導,且檢測到不同煙霧刺激下TLR-4水平是不一樣的,而對哮喘的研究也提示香煙煙霧提取物在支氣管哮喘大鼠中能夠誘導TLR-4/NF-κB的活化,上調細胞間黏附分子-1等細胞因子的表達而加重支氣管重塑,且氣道重塑程度跟TLR-4水平正相關[14]。我們的實驗結果與文獻報道相一致,TLR-4在煙霧暴露大鼠肺血管中有表達,且其表達水平與煙霧暴露量及血管重塑程度正相關。

綜上所述,煙霧暴露可上調TLR-4水平,誘導肺血管平滑肌細胞異常增殖,導致肺血管重塑程度加重。這可能是吸煙引起肺血管重塑的機制之一。