接種不同根瘤菌對紫花苜蓿生產力的影響

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(中國農業大學動物科技學院草業科學系 草業科學北京重點實驗室, 北京 100193)

人工施用化學氮肥和生物固氮是農業生產中植物獲得氮素的兩種有效途徑。化學氮肥的成本高、使用效率低，同時會污染水源和侵蝕土地，不利于環境的可持續發展。生物固氮將氮氣轉化為被植物吸收利用的氮素同時具有不污染環境，利用率高等優點。根瘤菌能誘導豆科植物根、莖上的皮層細胞增生形成瘤狀結節并在瘤中大量形成共生固氮的類菌體，供植物合成蛋白質[1]。在環境問題日益嚴峻的大背景下，苜蓿根系發達且對地面覆蓋度大，能夠有效防止雨水沖刷、減少水土流失，而且與根瘤菌共生固氮作用下能夠逐步提高土壤肥力和養分含量、改良土壤理化性，在我國生態建設中發揮著重要的作用[2]。但根瘤固氮存在菌體與植物特異性識別，此外還受多種因素的影響(如土壤條件)，因此在使用前要進行篩選，才能保證根瘤菌有效的起到固氮作用。

優質紫花苜蓿的干草蛋白質含量可達18%，粗蛋白消化率是70%，是可消化蛋白質最高的牧草之一[3]。2012年農業部和財政部共同啟動實施“振興奶業苜蓿發展行動”，在政策帶動和市場拉動下，優質植物性蛋白飼料的需求量大，苜蓿已成為不可替代的戰略性飼草[4-5]。但是目前國內苜蓿的產量和品質遠遠不能滿足市場的需要，如何提高苜蓿的品質和產量是我國目前發展紫花苜蓿產業迫切需要解決的問題。使用高效的根瘤菌接種是提高苜蓿生產力的最重要方法之一。根瘤菌篩選時不僅要考慮寄主植物的因素，還要考慮土壤環境的影響[6]。師尚禮等[7]以兩種苜蓿為材料在甘肅省5個生態區調查結果表明，在黑壚土生態區苜蓿根瘤菌的有效性最好，灰鈣土和灌淤土地區為其次，最差的是亞高山草甸土和褐土。寧國贊等[8]在內蒙古等23個省區的試驗結果表明：人工接種的根瘤菌相比土著根瘤菌，具有早結瘤、侵染力強等優點，苜蓿結瘤率和根瘤重量在人工接種根瘤菌后分別提高79.2%、40.7%，普遍增產效果達14%～100%。接種工程菌株相比接種野生型菌株則具有更高的固氮酶活性和總氮含量[9]。以上說明并不是所有菌株都能與豆科植物有良好的固氮效果，所以在生產實踐中對苜蓿高效根瘤菌進行篩選是必要的。

本研究希望在不同土壤類型下篩選出苜蓿根瘤菌與紫花苜蓿的優良共生匹配組合，從而為苜蓿生產提供與品種匹配的優良菌株，提高苜蓿產量和品質，促進苜蓿產業發展。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1苜蓿品種 試驗中使用了兩個苜蓿品種，分別是‘中苜3號’(MedicagosativaL. ‘Zhongmu NO.3’)，由中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所牧草研究室提供；‘龍牧806’(MedicagosativaL.×MedliloidesruthenicaSojak. ‘Longmu 806’)，由黑龍江省畜牧研究所牧草育種與栽培研究室提供。

1.1.2菌株 供試的5個根瘤菌由中國農業微生物菌種保藏管理中心(簡稱ACCC)提供(表1)，并以中國農業大學王濤教授實驗室饋贈的苜蓿中華根瘤菌Sm1021作為參比菌株，共6個苜蓿根瘤菌株。

表1 供試根瘤菌株及其來源Table 1 Rhizobia strain and its source region

1.1.3盆栽土壤 盆栽用土壤為泥炭土和沙土，土壤理化性質由北京市農林科學院植物營養與資源研究所測定(表2)。

表2 土壤理化性質Table 2 The soil properties

1.2 試驗方法

1.2.1根瘤菌活化 在無菌工作臺中用移液槍將供試的6株苜蓿根瘤菌株接入滅菌的YMA液體培養基中，YMA培養基配方：胰蛋白胨10.0 g·L-1，酵母提取物1.0 g·L-1，七水硫酸鎂(MgSO4·7H2O)1.0 g·L-1，蔗糖5.0 g·L-1，蒸餾水1 000 mL·L-1。放置在28℃、轉速為120 r·min-1的搖床中培養2～3天后，用分光光度計測定10個菌液的 OD600nm值，以較低OD600nm值菌液為標準(要求 OD600nm值大于0.5)，加入無菌水稀釋，將各菌株的培養液調整至相同 OD600nm值，備用。

1.2.2種子催芽與根瘤菌接種 選擇干凈、飽滿、色正、無壞死、無腐爛和無破損的苜蓿種子用95%乙醇浸泡5 min，無菌水反復清洗4～5次，再用潔爾滅溶液浸泡5 min，無菌水反復清洗6～8次。將消毒后的苜蓿種子播于滅菌培養皿中，置于20℃、日照時間8 h ，光照培養箱中催芽2～3天。幼根長至1～2 cm左右時，挑選長度適中、子葉完整飽滿的幼苗均勻播種至18 cm×15 cm 花盆中，泥炭土每盆約1.5 kg，沙土每盆約2.5 kg，土壤均滅菌，每盆播種3穴，每穴播種1顆催芽苜蓿苗，同時在苜蓿根部加入菌液5 mL，將土壓實。以不接種和Sm1021菌株作對照，重復3次。放置在溫度為22～25℃，光照時間為12～14 h的溫室中。隨時觀察，及時澆水，保持土壤濕潤。

1.3 數據分析

接種75天后收獲，測定各項指標(總根瘤數、植株高度、植株干重、全氮含量)。用Microsoft Excel錄入數據，并作圖。采用SPSS 17.0統計分析，用LSD法對各處理間的指標進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 2種盆栽土壤下‘龍牧806’苜蓿的篩選試驗

2.1.1泥炭土盆栽接種結果分析 總根瘤數中，菌株ACCC17675處理下根瘤數最高為125.7個，顯著高于對照CK(P<0.01)，但與Sm1021相比差異不顯著，其余4個菌株與對照相比均差異不顯著。株高中，供試5個菌株處理均顯著高于對照CK(P<0.05)，增長范圍在32.8%～90.6%之間，其中最大的是ACCC17578，株高為62.53 cm，同時菌株ACCC17578處理株高顯著高于Sm1021(P<0.05)，增加了30.3%。地上部干重中，供試菌株處理與對照CK、Sm1021間無顯著差異，菌株ACCC17578最大為2.734 g·株-1；各菌株處理地上部干重由高到低的順序為：ACCC17578>ACCC17675>ACCC17512 >ACCC17551> ACCC17537。根干重中，菌株ACCC17578高于對照CK但差異不顯著，但顯著高于Sm1021(P<0.01)，增長了107.0%；其它各菌株處理均低于對照CK，根干重由高到低的順序為ACCC17675>ACCC17512 > ACCC17537>ACCC17551。全氮量中，龍牧806中所有供試菌株均顯著高于對照CK(P<0.05)，增長范圍在32.1%～64.5%之間；菌株ACCC17578處理全氮量略高于Sm1021，其余都不同程度的低于Sm1021，見表3。

表3 ‘龍牧806’泥炭土盆栽接種根瘤菌比較Table 3 Comparison of different rhizobia strains inoculation in Longmu 806 peat potted soil

注：同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)

Note: Different letters in same column indicate significant difference at the 0.05 level. The same as below

2.1.2沙土盆栽接種結果分析 總根瘤數中，只有菌株ACCC17675處理下顯著高于對照CK(P<0.05)，增加了143.8%，所有菌株處理與Sm1021相比差異均不顯著。株高中，菌株ACCC17675與ACCC17578處理下高于對照CK，分別與CK相比增加13.2%和8.3%，其余菌株處理不同程度低于對照CK，但無顯著差異。地上部干重中，供試5個菌株處理與對照CK間差異不顯著，但是菌株ACCC17675處理顯著高于Sm1021(P<0.05)，增加了68.8%，其它各菌株處理地上部干重高于對照，順序為：ACCC17578>ACCC17551>ACCC17537>ACCC17512。根干重中，供試5個菌株處理與對照CK差異不顯著，但各菌株處理均高于Sm1021。菌株ACCC17675、ACCC17578處理顯著高于Sm1021(P<0.05)，分別增加了143.3%和131.7%，其它各菌株處理根干重由高到低的順序為：ACCC17537 >ACCC17551>ACCC17512,見表4。

表4 ‘龍牧806’沙土盆栽接種根瘤菌比較Table 4 Comparison of different rhizobia strains inoculation in ‘Longmu 806’ sand potted soil

2.2 2種盆栽土壤下‘中苜3號’苜蓿的篩選試驗

2.2.1泥炭土盆栽接種結果分析 ‘中苜3號’分別與5個苜蓿根瘤菌進行接種后，都有不同程度的結瘤情況。總根瘤數中，菌株ACCC17675、ACCC17551處理下根瘤數分別為78.3個和77.3個，均顯著高于對照CK(P<0.05)，但與Sm1021相比差異不顯著。株高中，供試5個菌株處理均顯著高于對照CK(P<0.01)，增長范圍在113.1%～165.8%之間，其中最大的是菌株ACCC17551處理，株高為68.13 cm，但與Sm1021相比無顯著差異。地上部干重中，供試菌株除ACCC17578處理均顯著高于對照CK(P<0.05)，增長幅度在147.6%～275.7%之間，其中菌株ACCC17551和ACCC17537處理下地上部干重高于Sm1021，分別為3.411 g、2.978 g，其余均不同程度低于Sm1021。根干重中，供試菌株ACCC17551處理高于對照CK但差異不顯著，但顯著高于Sm1021(P<0.01)，增長了84.9%，其它各菌株處理根干重由高到低的順序為：ACCC17537>ACCC17512>ACCC17675>ACCC17578。全氮量中，所有供試菌株都顯著高于對照CK(P<0.05)，增長范圍在22.0%～41.3%之間，與Sm1021相比均無顯著差異，見表5。

表5 中苜3號泥炭土盆栽接種根瘤菌比較Table 5 Comparison of different rhizobia strains inoculation in ‘Zhongmu No.3’ peat potted soil

2.2.2沙土盆栽接種結果分析 總根瘤數中，菌株ACCC17578處理顯著高于對照CK(P<0.01)和Sm1021(P<0.05)，分別增加了163.1%和54.8%。菌株ACCC17675、ACCC17551、ACCC17512處理均顯著高于對照CK(P<0.05)，分別增長了137.9%、103.4%、81.7%，與Sm1021無顯著差異。株高中，供試5個菌株處理與對照CK、Sm1021間均無顯著差異，菌株ACCC17512處理下最高為27.96 cm·株-1，各菌株處理株高由高到低的順序為：ACCC17512>ACCC17537>ACCC17578>ACCC17675>ACCC17551。地上部干重中，菌株ACCC17512處理顯著高于對照CK(P<0.05)，增長了48.6%，但與Sm1021無顯著差異，其它各菌株處理地上部干重均高于對照順序為：ACCC17537>ACCC17578>ACCC17675>ACCC17551。根干重中，菌株ACCC17512處理顯著高于對照CK和Sm1021(P<0.05)，分別增長了74.8%和6.7%，其它各菌株處理根干重量由高到低的順序為：ACCC17537>ACCC17578>ACCC17675>ACCC17551,見表6。

表6 ‘中苜3號’沙土盆栽接種根瘤菌比較Table 6 Comparison of different rhizobia strains inoculation in ‘Zhongmu No.3’ sand potted soil

3 討論

大量試驗研究表明，在不同的環境條件下，一種豆科植物可以與多種根瘤菌進行共生固氮，在同樣環境條件，不同豆科植物可與同一根瘤菌共生固氮[10]。豆科植物與根瘤菌共生固氮的效率在不同植株和菌種之間的差異主要是由宿主植物基因和根瘤菌基因共同調控[11]。僅接種高效的根瘤菌，才能獲得更好的苜蓿-根瘤菌共生固氮效果，從而提高苜蓿的產量與品質。

土壤環境對根瘤菌結瘤固氮效率具有很大的影響。根瘤菌接種效果在不同土壤類型中有很大差異，Hagen[12]在不同土壤類型中接種兩種根瘤菌，沙土中根瘤菌數量在153天后下降為10個·g-1土，黏土則上升為103個·g-1土，與沙土相比，2種菌株在壤土和粘土土壤中建立得更好。本試驗中‘龍牧806’和‘中苜3號’植株泥炭土中的長勢均比好于沙土；沙土條件下由于植株長勢較為緩慢，兩品種均未達到測定全氮量的標準，可見2種土壤對苜蓿根瘤固氮有很大的影響。推測其原因可能是兩種土壤營養元素含量不同導致的。有研究表明，影響苜蓿生長的主要因素是土壤中堿解氮、有效磷、速效鉀等的含量。根瘤菌與豆科植物共生固氮對磷素十分敏感[13-15]。缺磷會抑制根瘤菌的固氮和吸收[16]。鉀可以影響根瘤重量、根瘤數量和固氮效率。土壤中氮、磷、鉀的含量保持一定的水平可以促進根瘤的生長，否則含量過低或過高都會產生抑制作用。本試驗中泥炭土的堿解氮、有效磷、速效鉀的含量均遠遠高于沙土的，在同樣的接種條件下，泥炭土中的結瘤情況要好于沙土，說明土壤養分較為豐富更有利于根瘤的形成和植株的生長。

有效的根瘤菌含有豆血紅蛋白，形成的根瘤為粉紅色或紅色；無效的根瘤菌一般沒有豆血紅蛋白，呈微白色或淺綠色[17]。本試驗中在土壤滅菌的條件下，對照出現結瘤情況，說明種子中有內生根瘤菌，但均為白色無效根瘤，固氮能力低。在結瘤數量上，根據觀察發現，泥炭土壤下‘龍牧806’接種菌株ACCC17675 根瘤數最多，為125.7個，但所結根瘤大部分個頭小且顏色深；菌株ACCC17578所結根瘤雖然不多，有56.7個，但根瘤個頭大且顏色粉紅。沙土壤中，‘中苜3號’接種菌株ACCC17578所結根瘤最多，為76.3個，但是觀察看到根瘤為白色。有報道表明，篩選出的有效菌株每年固氮可高達300公斤N·公頃-1；然而無效菌株一年僅僅只能提供30公斤N·公頃-1甚至更少，影響植株的生長[18]。

試驗模擬自然條件篩選出不同土壤類型下‘龍牧806’和‘中苜3號’的共生固氮高效根瘤菌。但自然環境復雜，影響因素眾多，要真正發揮高效根瘤菌在農業生產實踐中的固氮作用，還要考慮土壤土著根瘤菌競爭等因素，在田間試驗中進行高效根瘤菌的篩選匹配驗證。此外，在實際紫花苜蓿生產中，要綜合考慮土壤肥力、氣候條件、土壤生物等環境因素，合理施用氮肥和接種根瘤菌，實現紫花苜蓿優質高產的生產目標。

4 結論

本研究表明，不同苜蓿品種、土壤條件和根瘤菌菌株對共生固氮有效性均存在差異。根據總根瘤數、株高、地上部干重、根干重和全氮量5項指標數據分析，篩選出優良匹配組合為泥炭土條件下為：‘龍牧806’-ACCC17578、‘中苜3號’-ACCC17551；沙土條件下為：‘龍牧806’-ACCC17675、‘中苜3號’-ACCC17512。試驗結果進一步說明根瘤菌與豆科植物共生固氮是由根瘤菌菌株、寄主植株和環境條件共同調控的。