長白山野生松針粉抗氧化及抗衰老作用的研究

孟永海，懷雪，翟春梅，李廷利，卞宏生，馬智超，孟祥瑛，王艷艷，，*

（1.黑龍江中醫藥大學教育部北藥基礎與應用研究重點實驗室，黑龍江哈爾濱150040；2.黑龍江中醫藥大學中藥藥理實驗室，黑龍江哈爾濱150040）

松針（pineneedle）為松科松屬植物的葉，別名豬鬃松葉、松毛、山松須[1]。松針歷史悠久，《本草綱目》記載“松針，氣味苦、溫、無毒，久服令人不老，輕身益氣，主治風濕瘡，生發，安五臟，守中，不饑延年。松針內富含糖類、粗蛋白、粗脂肪、氨基酸和微量礦物元素、維生素、抗菌素、生物黃酮類物質、莽草酸、精油、葉綠素、木脂素、不飽和脂肪酸、酶與輔酶等營養素和活性物質，具有很高的營養價值和藥用價值。松針的主要藥理活性有抗血小板聚集活性，降血脂，降血糖，鎮痛抗炎，祛痰及平喘，抗氧化，抗腫瘤，抗病毒，抗菌，抗突變效應，抗疲勞等藥理作用[2]。其活性成分和藥理作用決定了松針在食品保健方面的特殊性。早在上世紀90年代，將松葉的有效成分溶解于貴釀酒中，使該酒具有護肝、延緩衰老、降壓利尿等功效[3]。近年來，松針開發成含維生素C、維生素B1、維生素B2等對人體保健大有益處的松針飲料，具有潤肺益氣，除風止痛的松針茶，用松脂提取的天然香料等[4]。本文以衰老小鼠和果蠅為生物模式，對長白山野生松針的抗氧化及抗衰老作用進行研究，為其功能食品的研發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物

美國癌癥研究所（Institute of Cancer Research，ICR）雄性小鼠10只，ICR雄性老齡鼠20只，體重（20±2）g：均由黑龍江中醫藥大學藥物安全評價中心提供；野生型Canton S品系黑腹果蠅：由中國科學院上海生命科學院果蠅技術平臺提供。

1.2 試劑與儀器

松針：產自吉林長白山；MDA試劑盒、SOD試劑盒、BCA試劑盒、GSH試劑盒（批號均為20170809）：南京建成生物研究所；FJ-200高速萬能粉碎機：上海申勝儀器公司；HH.WZ.CY600電熱恒溫水浴鍋：上海精宏實驗設備公司；CT15RE高速冷凍離心機：日本HITACHI公司；AL 204電子天平：美國METTLER TOLEDO公司；EVOLUTION 260紫外分光光度計：美國THERMO公司；EPOCH12酶標儀：美國BIOTEK公司。

2 試驗方法

2.1 小鼠抗氧化實驗

選取ICR青年與老年小鼠30只，按照文獻方法加以改進[5]，分3組即老年給藥組、老年模型組、青年對照組。松針粉碎過篩，按照散劑配制[6]，給藥劑量為5 g/kg，給藥30 d。老年模型組、青年對照組給等體積的生理鹽水。末次給藥后，眼球取血，低溫離心，硫代巴比妥酸法測定血清中丙二醛（malondialdehyde，MDA）、羥胺法測定血清中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）的含量。冰上取肝組織，微板法測定肝組織中蛋白定量（bicinchoninic acid，BCA）[2]、比色法測定谷胱甘肽（glutathion，GSH）的含量。

2.2 果蠅壽命的實驗

果蠅培養基的制備采用基礎培養基配方：蒸餾水46 mL，玉米粉 4.2 g，蔗糖 3.1 g，瓊脂 0.3 g，在培養基中添加不同劑量（高1.845%、中0.461%、低0.115%）的松針粉，對照組則給予正常培養基飼養。煮沸至糊狀，停止加熱，待溫度降至60℃～70℃時，加入酵母粉0.3 g，攪拌均勻，加入丙酸0.3 mL，攪拌均勻，立即分裝至果蠅管中。參照文獻方法加以改進[7-9]，對果蠅行為學進行考察。

2.2.1 壽命實驗

收集12 h內羽化成蟲的果蠅，隨機分為對照組和給藥組，每組雌雄各100只，在（25±4）℃、相對濕度為（60±10）%、光/暗時間為12 h/12 h的恒溫恒濕智能培養室中培樣。每4天更換一次培養基并觀察記錄果蠅的情況。計算平均壽命，中間壽命，最高壽命。

2.2.2 亞急性氧化損傷實驗

取30日齡果蠅，每組雌雄各100只，果蠅饑餓兩小時后分別給予含20%的H2O2的6%的葡萄糖溶液，每4小時記錄一次，直至果蠅全部死亡。

2.2.3 衰老果蠅的攀爬實驗

收集12 h內羽化成蟲的果蠅，每組10只果蠅，雌雄各半。于第0、10、20、30天移入空的果蠅管中，觀察10 s內攀爬超過8 cm處的果蠅只數。每組重復實驗5次。

2.2.4 對果蠅體內水分含量的影響

收集12 h內羽化成蟲的果蠅，每組雌雄各50只，飼養至30 d，稱初重，放入干燥箱中（55℃），1 h后再次稱重，兩次重量差即為果蠅體內水分含量。每組重復實驗4次。

2.2.5 生殖實驗

分別取7、15、30 d蠅，每管雌雄各一只，飼養3 d后取出，記錄第1天出生的子代蠅個數，連續記錄7 d，每組實驗平行6次。

2.3 統計學處理

運用SPSS 17.0軟件進行方差分析（analysis of variance，ANOVA）單因素方差分析，數據以±s表示，組間做t檢驗，P<0.05則表示有顯著性差異，有統計學意義，P<0.01為極顯著性差異。（果蠅實驗中，給藥組雌果蠅與空白對照組雌果蠅比較，雄果蠅與空白對照組雄果蠅比較）。

3 結果

3.1 小鼠血清SOD、MDA含量以及肝組織GSH含量

小鼠血清SOD、MDA及肝組織GSH含量見表1。

表1 小鼠血清SOD、MDA及肝組織GSH含量（n=10）Table 1 The content of SOD，MDA，and liver homogenate GSH in mice（n=10）

與老年模型組相比，青年對照組MDA、SOD及肝組織GSH含量均有極顯著差異（P<0.01），說明正常生理下衰老小鼠與青年小鼠相比，衰老指標發生明顯變化。但老年給藥組SOD和GSH含量與老年模型組相比，有顯著性差異（P<0.05），MDA含量雖無顯著性差異，但有降低趨勢。這可能與給藥時間不足有關。此實驗表明，給與一定劑量的松針粉，可回調衰老小鼠的抗氧化指標，有一定的延緩衰老的效果。

3.2 松針粉對果蠅壽命相關行為學指標考察結果

3.2.1 松針粉對果蠅壽命的影響

松針粉對果蠅壽命的影響見表2。

與果蠅空白對照組相比，各給藥組的果蠅平均壽命和最長壽命，均有不同程度的延長，與對照組相比，各給藥組雌雄果蠅平均壽命均呈現極顯著差異（P<0.01），中、低劑量組雌雄果蠅的最長壽命也呈現極顯著性差異（P<0.01）。說明果蠅終身補充一定劑量的松針粉，可延長自身壽命。

果蠅壽命存活率見圖1。

表2 松針粉對果蠅壽命的影響（n=100）Table 2 Lifespan parameters in drosophila following pine supplement（n=100）

圖1 果蠅壽命存活率折線圖（n=100）Fig.1 Graph of drosophila melanogaster’s survival rate（n=100）

3.2.2 松針粉對果蠅亞急性氧化損傷實驗

松針粉對果蠅亞急性氧化損傷的作用見表3。

在亞急性氧化損傷實驗中，與空白對照組相比高劑量組雌雄平均存活時間呈現極顯著性差異（P<0.01）；中劑量組雌雄果蠅呈現顯著性差異（P<0.05）；低劑量組均無顯著性差異。

3.2.3 松針粉對不同時期果蠅的攀爬活動的影響

松針粉對不同時期果蠅的攀爬活動的影響見表4。

表3 松針粉對果蠅亞急性氧化損傷的作用（n=100）Table 3 Survival time parameters in drosophila exposed to H2O2 following pine supplement（n=100）

表4 松針粉對不同時期果蠅的攀爬活動的影響（n=5）Table 4 Climbing ability in drosophila following pine supplement（n=5）

與空白對照組相比，各給藥組10日齡雄果蠅的攀爬能力有極顯著性差異（P<0.01），低劑量組雌果蠅攀爬能力顯著增加（P<0.05）；高、中劑量給藥組20日齡雄果蠅的攀爬能力顯著增加（P<0.05或P<0.01），中劑量組雌果蠅的攀爬能力有極顯著性差異（P<0.01）；高劑量組30日雄果蠅的攀爬能力有極顯著性差異（P<0.01）。果蠅攀爬實驗折線圖見圖2。

3.2.4 松針粉對果蠅體內水分含量的影響

松針粉對果蠅體內含水量的影響見表5。

圖2 果蠅攀爬實驗折線圖Fig.2 Climbing ability in drosophila following pine supplement

表5 松針粉對果蠅體內含水量的影響（n=4）Table 5 Detection of water content in drosophila in each group（n=4）

與空白對照組相比，高劑量組體內水分含量無顯著性差異；中劑量組呈現極顯著差異（P<0.01）；低劑量組雄果蠅與對照組相比，有顯著性差異（P<0.05）；研究發現各組雌果蠅的體內含水量明顯高于雄果蠅。

3.2.5 松針粉對果蠅繁殖能力的影響

松針粉對果蠅繁殖能力的影響見圖3。

圖3 不同日齡果蠅繁殖果蠅數統計Fig.3 Reproduction parameters in drosophila following pine supplement

與空白對照組相比，各階段高劑量組果蠅子代個數減少，中劑量組果蠅子代數增加（P<0.05或P<0.01），低劑量組30 d果蠅的子代數有顯著差異（P<0.01）。值得注意的是，隨著日齡增加對照組果蠅子代數呈降低趨勢，而終生補充低劑量松針粉的果蠅隨著日齡增加，果蠅子代數呈上升趨勢，尤以30日齡的果蠅產的子代數最多，可見終生低劑量補充松針粉可大大提高老年時期生物的繁殖能力，功效明顯。

4 討論

清除自由基延緩衰老[10]的學說被越來越多人認可，衰老過程中自由基促成的脂質過氧化作用亦隨齡增高[11]，SOD是存在于生物體內的抗氧化酶系，能有效地清除細胞代謝過程中產生的氧自由基[12]，GSH可以認為是生物體內氧自由基消除系統的重要防線，主要起保護細胞膜結構和功能的作用[13]。細胞中的脂類物質受到氧自由基作用時，發生脂質過氧化反應，產生一些分解產物如MDA等。MDA作為機體脂質過氧化反應的最終代謝產物，其高低又間接反應了機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度[14-15]。

檢測動物的壽命是目前研究老齡化和抗老齡化中應用普通、較有權威的試驗手段之一，果蠅這種模式生物[16]用于壽命實驗的先進性和機理探討的優勢較為明顯，其優點在于生命周期短、繁殖力強[17]，遺傳背景清晰又具有相對簡單的腦[18]，有方便的遺傳學工具[19]，且基因組小[20]，易于分析操作。

小鼠抗氧化實驗中老年給藥組與老年模型組相比，MDA含量略降低，SOD、GSH含量明顯升高，說明松針粉對老齡小鼠有一定的抗氧化效果。影響果蠅壽命存在多種因素[21-22]，在盡可能保證外界因素一致的情況下進行果蠅壽命實驗，結果發現松針可顯著性延長各個給藥濃度的雌雄果蠅壽命。大量文獻已報道松針具有體外抗氧化能力[23-25]，在果蠅培養基中添加不同濃度松針粉喂養30 d后，進行氧化損傷實驗中，隨著藥物濃度的增加與果蠅平均存活時間成正相關，說明松針不僅在體外有一定的抗氧化作用，而且在動物體內也有顯著的抗亞急性氧化損傷效果。運動和衰老息息相關[26]，利用正常果蠅具有反趨地性行為的特性進行攀爬測試[27]，松針粉可以提高和改善老年果蠅的攀爬運動能力，增加老年果蠅體內含水量，改善果蠅物質代謝與能量代謝。中、低濃度的松針粉還可增加果蠅的子代數，這些實驗說明松針粉可通過提高機體抗氧化能力而抗衰老，其機理可能與其提高抗氧化酶的活性及其抑制脂質過氧化物的產生等一系列抗氧化作用密切相關。其分子機制有待深入研究，它必將在如今老齡化社會發揮更大作用。