側流層析技術研究進展

馬 蘭，王淑娟，曾海娟，謝曼曼，丁承超，翟緒昭，郭 亮，孫靜娟，李 杰，胡 謙，劉 箐*

（上海理工大學醫(yī)療器械與食品學院，上海 200093）

近年來，快速檢測需求的增加刺激了新技術在臨床診斷、環(huán)境監(jiān)測和食品安全分析等領域的發(fā)展。目前已有很多技術可用于檢測小分子和生物大分子，包括氣相色譜-質譜聯用技術、高效液相色譜-質譜聯用技術、高效液相色譜技術、酶聯免疫吸附檢測（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）技術和生物傳感器技術等。這些技術大都特異性強、靈敏度高，但耗時長且需要昂貴的儀器以及專業(yè)的操作人員。和傳統(tǒng)方法相比，側流層析技術（lateral flow chromatographic assay，LFCA）有很多優(yōu)勢，如成本低、易操作、快速、可實現現場檢測及結果肉眼可見等[1-3]。基于上述優(yōu)勢，自LFCA出現以來，其在基礎及應用研究領域取得了快速的發(fā)展。

1980年首次研制出檢測人絨毛膜促性腺激素的LFCA試紙被用以診斷早孕。自此以后，LFCA被廣泛的運用于檢測各種分子，包括腫瘤標志物、微生物、霉菌毒素、重金屬和農藥等。本文主要從LFCA的原理、技術結構、研究動態(tài)等方面予以闡述。

1 LFCA的技術原理及設計

LFCA主要是基于免疫識別或者核酸雜交以及抗體標記技術，使待檢測物中各組分（抗原、抗體、蛋白質、核酸等）通過毛細管作用力的移動速度差異，在反應基質上實現分離的色譜系統(tǒng)[4-6]。

1.1 LFCA的基本組成

LFCA由4 個部分組成，即樣品墊、結合墊、層析膜和吸水墊，將這4 個部分疊加于支撐底板上就構成了一個簡易的LFCA試紙條（圖1）。樣品墊為經過處理的纖維膜或玻璃棉，用于快速吸收待檢樣品，使其利用毛細管作用向結合墊方向側向流動。結合墊為纖維膜或玻璃棉，吸附有標記的生物活性材料（如金標抗體），它可與待檢樣品溶液里的檢測靶標結合形成肉眼可見的免疫復合物。層析膜大都為硝酸纖維素（nitrocellulose，NC）膜，它是LFCA的關鍵材料，為分析物之間的反應提供了平臺，其上固定有兩條或多條不同生物活性物質（如抗原或抗體）噴印的“檢測（test，T）線”和“質控（control，C）線”，用于攔截帶標記的免疫復合物，并可直觀地顯示檢測結果。吸水墊為吸水紙板，用于吸收流過層析膜的待檢樣品，以平衡層析膜兩邊的壓差，促使更多待檢樣品在層析膜上側向流動[7]。

圖 1 LFCA試紙條結構示意圖Fig. 1 Structural diagram of LFCA test strip

LFCA是一項基于抗原抗體特異性結合或核酸探針和靶向核酸雜交反應來檢測樣品中目標物質的有效技術。其中，當抗體被用作生物識別因素時，LFCA又叫免疫層析試紙快速檢測技術。它是一種20世紀80年代發(fā)展起來的將標記免疫技術和色譜層析技術結合起來的固相膜免疫分析方法，依據其免疫層析反應時抗原與抗體結合方式的不同，主要分為兩類，即雙抗體夾心免疫層析法和競爭免疫層析法[8]。

1.2 基于抗體抗原結合的LFCA

1.2.1 雙抗體夾心免疫層析技術原理

由于含有較多的抗原位點，雙抗體夾心法適用于檢測大分子物質。該模式中使用了3 種抗體：第一種是被標記材料標記在結合墊上的將與樣品中抗原特異性結合的單克隆抗體1（monoclonal antibody 1，mAb1）；第二種是噴印在T線上的與不同抗原決定簇結合的捕獲單克隆抗體2（monoclonal antibody 2，mAb2）或多克隆抗體（polyclonal antibody，pAb）；第三種是被噴印在C線上的抗種屬特異性免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）的“抗抗體”（俗稱二抗）。

以膠體金標記法為例，其檢測原理如下：利用待測抗原上的兩個抗原決定簇A和B分別與結合墊上的金標抗體和T線上的捕獲抗體結合，形成“金標抗體（mAb1）-待測抗原-捕獲抗體（mAb2或pAb）”復合物；該復合物因為有膠體金的緣故而顯紅色，復合物的形成量與待測抗原含量成正比[9]，C線將未被T線攔截的金標抗體mAb1及部分抗原-金標抗體復合物攔截并反應顯色。于是，當滴加到樣品墊上的待測樣品通過毛細管作用向前層析到結合墊上時，會溶解其上的金標抗體并一同向前涌動：如果樣品中含有抗原，T線和C線均會顯現紅色；反之，T線無條帶，C線顯紅色（圖2）；C線不顯色則結果不能判斷。

圖 2 雙抗體夾心LFCA原理圖[10]Fig. 2 Schematic diagram for the principle of sandwich LFCA[10]

1.2.2 競爭免疫層析法原理

小分子不能同時結合兩種及兩種以上的抗體，而競爭法檢測模式為競爭抑制性的免疫學結合反應，所以競爭法適用于抗原位點較少或僅有單個抗原位點的小分子化合物的檢測。該方法中使用了兩種抗體，一種是與樣品中抗原特異性結合的抗體，另一種是噴印在C線上的二抗。與雙抗體夾心法不同的是，競爭免疫層析法試紙條結果表現為：若樣品中無靶標抗原，則T線和C線處均顯現條帶；反之，若樣品中有靶標抗原，則C線處顯現條帶，T線處無條帶，T線條帶顏色深度與靶標抗原含量成反比；C線不顯條帶則結果不能判斷。

競爭法分兩種模式，一種用于檢測抗原，另一種是當抗原材料中的干擾物質不易除去或不易得到足夠的純化抗原時，用來檢測特異性抗體。以膠體金標記為例，在第一種檢測抗原的模式中，用膠體金標記一定量的靶標抗原并固定在結合墊上，T線與C線分別噴涂與靶標抗原特異性結合的抗體（一抗）以及抗種屬特異性IgG的“抗抗體”（俗稱二抗）：對于陰性樣品，金標抗原隨樣品側向流動，在T線處與一抗結合，在C線處與二抗結合，結果T線和C線均顯現紅色；對于陽性樣品，樣品中未被標記的靶標抗原和結合墊上金標的靶標抗原通過競爭與T線處的一抗結合，樣品中的靶標抗原越多，結合在T線上的金標抗原越少，顯色也就越淺，而過量的金標抗原與C線處的二抗結合，故只有C線顯現紅色（圖3）。

圖 3 競爭法LFCA原理圖（模式一）Fig. 3 Schematic diagram for the principle of competitive LFCA (mode 1)

圖 4 競爭法LFCA原理圖（模式二）Fig. 4 Schematic diagram for the principle of competitive LFCA (mode 2)

在第二種檢測抗體的模式中，將抗體用膠體金標記在結合墊上，T線和C線分別包含抗原與載體分子（通常為牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA））的結合物以及抗種屬特異性IgG的“抗抗體”（俗稱二抗）。樣品中的靶標抗體和結合墊上的金標抗體共同競爭T線上的抗原與載體分子的結合物：對于陰性樣品，結合墊上的金標抗體分別與T線和C線上的固定物反應結合，使T線和C線均顯現紅色；對于陽性樣品，樣品中的靶標抗體會優(yōu)先和T線上的抗原與載體分子的結合物特異性結合，樣品中的靶標抗體越多，結合在T線上的金標抗體就越少，顯色也越淺，而過量的金標抗體與C線處的二抗結合，故只有在C線處顯現紅色（圖4）[6,11-12]。

1.3 基于核酸的LFCA

由于親和素和生物素間特異性強、親和力大、可分別結合各種大小分子而構成親和素-生物素系統(tǒng)（avidinbiotin system，ABS），將核酸和LFCA結合起來。類似ABS，生物素-生物素抗體、生物素-鏈霉親和素、熒光素-熒光素抗體、地高辛-地高辛抗體等系統(tǒng)也具有這種橋梁連接作用。基于此，互補的核苷酸序列（DNA與DNA、DNA與RNA、RNA與RNA等）通過Watson-Crick堿基配對形成非共價鍵，從而形成穩(wěn)定的同源或異源雙鏈分子的核酸雜交過程，核酸也可被用作LFCA的生物識別元件。檢測結果及分析如下：T線和C線均顯條帶者為陽性樣品；C線顯色而T線不顯色者為陰性樣品；C線不顯色則結果不能判斷。依據方法過程中是否需要抗體，基于核酸的LFCA中分為兩種類型，一種是抗體依賴型（又稱“核酸側流免疫（nucleic acid lateral flow immunoassay，NALFIA）”），另一種是抗體非依賴型（又稱“核酸側流檢測試紙條（nucleic acid lateral test strips，NALTS）”）。

1.3.1 NALFIA技術

抗體依賴型LFCA中運用了核酸-抗體相互作用以及雙鏈DNA的特異性標記，因此又被稱為NALFIA。NALFIA其實是聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）技術與ELISA技術的結合應用。

以膠體金NALFIA為例：首先針對檢測靶標特異性基因片段設計一對相應的PCR引物，并對其進行兩種不同標記物標記（如用生物素標記一條引物，而用熒光素標記另一條引物），通過PCR擴增產生雙標記的雙鏈擴增產物；制作試紙條，在結合墊上固定一定量能與擴增子標記物之一特異性結合的物質（如鏈霉親和素或親和素）和膠體金的復合物，T線噴涂特異性抗擴增子另一標記物的抗體的標記物（如熒光素抗體），C線噴涂能與結合墊上復合物特異性結合的物質（如生物素）；用制作的膠體金試紙條對PCR產生的擴增產物進行檢測。

對于陽性樣品，雙標擴增子由于毛細管作用力從樣品墊側流至結合墊，其上的生物素與結合墊上的鏈霉親和素或親和素特異性結合，復合物又側流至T線后，雙標擴增子上的熒光素與T線上的熒光素抗體特異性結合，結合墊上過量的鏈霉親和素或親和素又與C線上的生物素特異性結合，又因結合墊上鏈霉親和素或親和素被膠體金標記，所以T線與C線同時顯紅色；對于陰性樣品，結合墊上的鏈霉親和素或親和素與C線上的生物素特異性結合，所以只有C線顯紅色；C線不顯色則結果不能判斷。

1.3.2 NALTS技術

抗體非依賴型LFCA因不依賴抗體而被稱作NALTS。與NALFIA不同的是，NALTS的被檢樣品是單鏈核苷酸而非雙鏈核苷酸，它的關鍵步驟是核酸雜交。核酸適配體是一小段經體外篩選得到的人造短鏈單鏈寡核苷酸（RNA或DNA），它們能特異性識別并結合靶向核酸且易于合成，并且在標記過程中不會失去活性，因此，核酸適配體常被用在NALTS中代替抗體發(fā)揮作用[13]。以膠體金NALTS為例，結合墊上固定一定量被膠體金標記的捕獲探針與標記物（如生物素）的結合物，T線噴涂結合探針或其與BSA的結合物，C線噴涂與結合墊標記物特異性結合的標記物（如鏈霉親和素）。

對于陽性樣品，單鏈擴增子與結合墊上的捕獲核酸探針雜交，復合物又與T線上的結合探針雜交，C線上的鏈霉親和素與結合墊上過量的生物素特異性結合，又因結合墊上捕獲探針與生物素被膠體金標記，所以T線和C線同時顯紅色條帶；對于陰性樣品，C線上的鏈霉親和素與結合墊上的親和素特異性結合，所以只有C線顯紅色條帶；C線不顯色則結果不能判斷。

NALFIA和NALTS因檢測原理不同，檢測靈敏度和時間也有所不同。因為雜交過程比標記物之間的親和反應更耗費時間，所以NALTS需要的檢測時間比NALFIA長；而靈敏度則與更多條件有關，無法給出統(tǒng)一結論。例如，赭曲霉毒素A是曲霉和青霉家族的次級代謝產物，它是一種小分子，適用于競爭性LFCA。基于適配子[14]和抗體[15]的LFCA可用于赭曲霉毒素A的檢測。基于NALTS的檢測限可達0.18 ng/mL[14]，基于NALFIA的檢測限為0.5 ng/mL[15]。

2 LFCA的影響因素

2.1 抗體

LFCA的靈敏度和特異性是基于免疫反應物的選擇。綜上所述，LFCA對抗體種類和質量都要求極高，所選抗體必須具有高親和力、敏感性和特異性，且在LFCA中往往需要一組配對的抗體（標記抗體和T線抗體），提高了對抗體的要求及開發(fā)LFCA的難度。針對此問題，2016年Song Chunmei等[16]首次發(fā)明了只用一種抗體對食源性致病菌進行半定量免疫熒光試紙檢測技術，實際樣品中大腸桿菌O157∶H7的檢測時間為5～10 min。

2.2 NC膜

影響LFCA檢測限的另一個關鍵因素是NC膜的選擇，不同孔徑的膜對檢測限和檢測時間影響不同。Laura[17]和Majdinasab[18]等使用Hi-Flow 180和Millipore NC膜，檢測限分別是1.5 ng/mL和0.25 ng/mL，檢測時間分別是20 min和15 min。

2.3 標記材料

標記材料同時承擔LFCA檢測結果的“可視化”和“抗體標記”兩大功能，對該方法的靈敏度、檢測限等性能至關重要。納米金顆粒具有穩(wěn)定性高、抗體相容性好、顯色清晰等優(yōu)點，是LFCA最常用的抗體標記材料。近年來，碳納米材料、量子點、上轉換熒光材料、超順磁性納米顆粒等新型標記材料的研究取得了突破性的進展，使檢測性能大幅度提升。2015年Wang Chunying等[19]利用多色量子點標記抗體，同時對甲胎蛋白和癌胚蛋白進行雙靶標檢測，檢測限分別可達3 ng/mL和2 ng/mL，并可在15 min內得到檢測結果，其靈敏度高于ELISA方法。

3 LFCA研究進展及應用

LFCA中，標記物是影響其靈敏度的關鍵因素之一。對抗體或抗原進行標記，通過標記物的增強放大效應顯示反應系統(tǒng)對應的抗原或抗體的相對含量。

3.1 LFCA的標記材料

根據標記原理可分為兩大類：一類是以酶促反應為基礎的酶標記法；另一類是自顯色標記法。對于不需要儀器輔助的免疫層析試紙，主要是自顯色標記[7]。為增加試紙的靈敏性，人們一直在不斷尋找新型的標記物，包括納米顆粒（金納米顆粒、碳納米顆粒）、發(fā)光納米顆粒（量子點、熒光猝滅材料、上轉換熒光材料）、超順磁納米顆粒、脂質體和酶等標記物，目前應用最廣泛的是膠體金標記[20]。

3.1.1 納米顆粒

納米顆粒因其特有的光學性質（包括由組件和聚集產生的熒光或顏色變化）而被用作LFCA的示蹤劑[21]。目前，膠體金、銀和碳納米顆粒、碳納米管已被廣泛應用于開發(fā)LFCA[22]。

3.1.1.1 膠體金

膠體金易于制備、成本低，可視化顏色形成較快，在液態(tài)或是干燥狀態(tài)下非常穩(wěn)定，不易褪色，廣泛應用于許多領域。但是，膠體金的形狀、大小、均一性和穩(wěn)定性是影響膠體金試紙條成功與否的關鍵因素。膠體金的顏色、大小與還原金的檸檬酸三鈉數量密切相關[23]。同時，膠體金的標記還受多種因素的影響，如配體和膠體金的酸堿度以及膠體金和配體蛋白的比例等[24]。

3.1.1.2 碳納米管和碳納米顆粒

碳納米顆粒因其表面積大、光電特性良好而被應用于側流免疫層析技術（lateral flow immunochromatographic assay，LFICA）分析中，其顏色比膠體金深，非常適合做標記材料，而且成本低、易制備、綴合穩(wěn)定[25]。然而，碳納米顆粒的標記效果會受反應時間和反應溫度等條件影響[26]，碳納米顆粒的廣泛應用還會給環(huán)境和人類健康帶來不利影響[27]。

3.1.1.3 其他納米材料

其他用于LFCA的納米材料有Fe3O4@Si納米顆粒[28]、硅原子納米顆粒[29]、乳膠微球[30]、鉑納米顆粒[31]等。其中，乳膠微球因其來源廣泛且價格低被廣泛應用，其可通過氨基、羰基和巰基產生的簡單吸附和共價連接與很多物質偶聯，其操作簡便、穩(wěn)定可靠、靈敏度高，但是需加碳二亞胺/N-羥基丁二酰亞胺活化乳膠微球中的反應基團才能有效標記結合抗體或抗原。

3.1.2 熒光納米顆粒

最近許多研究表明，使用熒光納米顆粒比使用比色標記材料獲得的檢測限更低[32]。熒光納米顆粒背景信號低、干擾少、靈敏度高、熒光素價格低廉，表面不需要修飾即可直接偶聯生物特異性抗體。然而其熒光信號不穩(wěn)定、容易猝滅，而且半定量分析的精確度欠佳。

3.1.2.1 量子點

擁有窄發(fā)射光譜、寬激發(fā)范圍和高熒光量子產率的量子點[33]，具有優(yōu)異的亮度、尺寸可調的熒光發(fā)射、較大的吸收系數、良好的穩(wěn)定性和高信噪比，已廣泛用于提高LFCA檢測靈敏度。然而，量子點標記能誘導氧自由基的產生，因此對生物活性物質具有一定毒性，不過這些毒性可以通過偶聯到蛋白質分子上或者是覆蓋一層低毒物質來降低。量子點和某些蛋白質結合后可能導致量子點的熒光減弱或猝滅，如銅/鋅-超氧化物歧化酶對CdSe量子點的熒光有明顯的猝滅作用。另外，如果量子點標記用于試紙的制備，其使用過程中需要紫外光源用于色澤變化的觀察，與肉眼觀察即可判斷檢測結果的其他類型試紙相比操作程序稍顯復雜。

3.1.2.2 熒光猝滅材料

熒光猝滅材料（有機熒光染料、熒光蛋白、膠體金和量子點等）已經被用來檢測小的分析物，并且有研究發(fā)現信號強度和分析物的濃度呈正相關[32]。這些材料具有背景信號低、靈敏度高、可以標記多個生物識別元件的優(yōu)點。

3.1.2.3 鑭系元素

已經用于標記LFCA以提高其檢測限的鑭系元素螯合物有Eu3+、Tb3+、Sm3+和Dy3+，它們作為標記材料的原理是熒光反應，因其納米顆粒與膠體金的尺寸相當接近并且消除了背景熒光而被選為LFCA的標記材料。與常規(guī)的熒光標記和量子點相比，它們具有獨特且有應用優(yōu)勢的熒光特性，例如熒光壽命長、發(fā)射光譜窄、斯托克斯位移大、光穩(wěn)定性突出等。

3.1.2.4 上轉換熒光體

上轉換熒光體是一種含鑭系元素的亞微米尺寸的陶瓷顆粒，其特殊的組成和結構具備了優(yōu)良的光學特性，當被紅外光激發(fā)時，它可以發(fā)射可見光。與其他熒光標記相比，它的主要優(yōu)點有靈敏度高、保質期長、永久記錄（無褪色）、基質干擾低、成本低等。

3.1.2.5 其他熒光材料

研究者常用熒光信號來增強檢測信號以提高LFCA的靈敏度。熒光微球（fluorescent microspheres，FM）具有穩(wěn)定的構型和高熒光強度，是多彩和安全的標記材料。由于膠體金應用時缺乏靈敏度，FM主要用于檢測幾種化合物，如黃曲霉毒素M1[34]、腫瘤壞死因子α[35]等。

3.1.3 超順磁納米顆粒

超順磁納米顆粒因其穩(wěn)定的磁信號而被裝置完全捕獲，可使檢測的靈敏度提高10～100 倍，使檢測時間縮短。然而它會產生背景噪聲，由于利用磁微粒標記建立的快速檢測技術需要使用外界磁場，因此與膠體金標記相比較為麻煩。另外，磁微粒具有較大的表面自由能和強磁偶極矩相互作用，彼此間易聚集，如果包被不良也會影響試紙的檢測結果。

3.1.4 酶

酶與底物反應形成的顏色可以通過肉眼和標準的顏色圖表比色，直觀反應檢測物的有無。但其分析靈敏度不高，且比色時可能會帶來由于人為錯誤判斷引起的不精確性。另外，酶是一種生物活性物質，如果保存不當，催化性能就會喪失。

3.1.5 脂質體

脂質體是由一個或多個磷脂雙層組成的球形人工小泡，因其具有捕獲高濃度信號分子的能力，脂質體診斷裝置可以把可視免疫層析的靈敏度提高2～3 個數量級。但其穩(wěn)定性低、操作復雜，因此應用較少。

3.2 基于核酸LFCA的標記材料

基于核酸LFCA的標記原理是堿基配對，將帶有標記物的已知序列的核酸片段和與其互補的核酸序列雜交形成雙鏈，用以檢測未知樣品中是否具有與其相同的序列，并能進一步判定其與已知序列的同源程度。根據標記材料是否具有放射性可分為放射性標記材料和非放射性標記材料。

3.2.1 放射性標記材料

放射性同位素被用作標記物，常用的有32P、3H、35S。放射性標記材料的優(yōu)點是靈敏度高，缺點是易造成放射性污染，同位素半衰期短、對人體有傷害。

3.2.2 非放射性標記材料

生物素和地高辛被用作非放射性標記材料，二者都是半抗原。生物素一親和素系統(tǒng)是一種具有親和力高、靈敏度高、特異性強和穩(wěn)定性好等優(yōu)點的信號放大標記技術[36]。生物素標記對身體無害，但受到紫外線的照射后易發(fā)生分解。地高辛標記與放射性同位素標記探針的靈敏度相當，并且特異性優(yōu)于生物素標記[37]。

3.3 LFCA的應用現狀

20世紀90年代開始，層析試紙技術以其價格低廉、方便攜帶使用、不需要專業(yè)人員、支持現場快速檢驗以及結果肉眼可見等優(yōu)勢，在人類、動物、植物醫(yī)學臨床檢測以及環(huán)境監(jiān)測、食品安全檢測等領域被廣泛應用。

3.3.1 LFCA在人類醫(yī)學及動、植物醫(yī)學檢測領域的應用

在LFCA建立并發(fā)展的早期，人們就將研究的目的放在了其在人類疾病診斷、預警、生理生化指標的分析上。后來，隨著畜牧養(yǎng)殖業(yè)和種植業(yè)的不斷發(fā)展，動植物疫病對其危害也不斷加劇。迄今為止，有大量試紙已經成功應用于人類腫瘤性疾病、病毒性感染、細菌性傳染、動、植物性病毒病、細菌病、寄生蟲病等的快速檢測上。

表 1 LFCA在人類醫(yī)學及動、植物醫(yī)學檢測領域的應用Table 1 Application of LFCA in the fields of clinical medicine, and animal and plant medicine

由表1可見，目前LFCA在醫(yī)學領域應用甚廣，涉及人類、動物和植物，且以膠體金標記雙抗夾心法為主，其檢測靈敏度可達ng/mL級，分析時間均在1 h之內。由于膠體金易于制備、成本低、顏色形成較快、不易褪色，加上醫(yī)學領域檢測靶標抗原大都是大分子物質，含有較多的抗原位點，使膠體金標記雙抗夾心法被高度的應用在人類醫(yī)學及動、植物醫(yī)學檢測領域，為醫(yī)學發(fā)展作出了巨大貢獻。膠體金作為層析試紙標記材料由來已久、應用甚多，更多更高效的標記材料及方法值得研究者繼續(xù)并深入研究以取得更大成就。

3.3.2 LFCA在食品安全領域的應用

目前，“從農田到餐桌”的食品安全問題日益復雜化，食品安全問題頻發(fā)。病原微生物造成人體食物中毒，農獸藥濫用處于無序狀態(tài)，重金屬超標構成糧食產品安全隱患，違法添加、摻雜摻假現象報道此起彼伏，食品安全已經成為困擾人民健康生活的大問題。為響應人民的需求，方便快速、低成本、節(jié)省時間、結果肉眼可見的LFCA已在包括食源性致病菌、農獸藥殘留、違禁添加劑、生物毒素、重金屬離子檢測等領域被越來越多的應用[47]。

表 2 LFCA在食品安全領域的應用Table 2 Application of LFCA in the field of food safety

由表2可見，現階段LFCA在食品安全領域應用甚廣，主要應用于食源性致病菌和農獸藥殘留檢測兩大方面。對微生物檢測主要以雙抗夾心法為主，而在農獸藥殘留檢測領域大都采用競爭法。這些方法中膠體金作為標記材料的應用非常廣泛，為了提高靈敏度，近年來對一些新型標記材料的應用也有很多研究，比如量子點、磁性納米顆粒、上轉換熒光材料等。LFCA法對微生物的檢測限高達10～108CFU/mL，農獸藥殘留的檢測限高達30 ng/mL～0.1 mg/L，檢測時間縮短至1～20 min。

3.3.3 LFCA在環(huán)境監(jiān)測領域的應用

伴隨社會生產力發(fā)展而來的環(huán)境污染和破壞問題已經成為威脅人類生存和發(fā)展的重大世界性問題，對此各國環(huán)保委員會發(fā)起環(huán)保聯合聲明，表示環(huán)境污染物的監(jiān)測為環(huán)保的首要環(huán)節(jié)。LFCA以其快速、可現場檢測等優(yōu)點被廣泛應用在環(huán)境監(jiān)測中。

表 3 LFCA在環(huán)境監(jiān)測領域的應用Table 3 Application of LFCA in the field of environmental monitoring

由表3可見，現階段LFCA在環(huán)境監(jiān)測領域應用范圍廣但不全面，原因可能有二：其一，環(huán)境問題在以前并不嚴重，后來也并未得到真正重視；其二，環(huán)境監(jiān)測層析試紙開發(fā)困難較大、環(huán)境樣品不易收集處理等。目前應用于環(huán)境監(jiān)測的LFCA試紙條靈敏度可達ng/mL數量級，檢測時間短至10 min左右。LFCA可被應用在環(huán)境監(jiān)測領域，為環(huán)境中水、空氣、土壤等污染的監(jiān)督管理工作提供便利。但對其他環(huán)境污染物的檢測開發(fā)還需進一步研究和探索，以完善對其的監(jiān)督和管理。

4 LFCA與其他分析技術的比較

LFCA不需要專業(yè)操作人員和昂貴的儀器設備即可實現對抗原、抗體和半抗原等各種分析物的定性和半定量檢測，在勞動力稀缺的地區(qū)起著重要作用，還可在短時間內對幾種化合物進行同時檢測。圖5對LFCA試紙檢測技術的優(yōu)缺點進行了總結。

圖 5 LFCA試紙條的優(yōu)缺點[24]Fig. 5 Advantages and disadvantages of LFCA test strip[24]

4.1 LFCA與傳統(tǒng)微生物學檢測方法的比較

傳統(tǒng)微生物學檢測方法中樣品需要經增菌、分離培養(yǎng)和生化鑒定等步驟，完成一次檢測一般需要5～8 d。相比之下，LFCA除增菌外僅需幾十分鐘甚至幾分鐘的檢測時間，檢測快捷、靈敏度更高[68]。

4.2 LFCA與儀器分析化學技術的比較

目前，在檢測農、獸藥以及重金屬殘留方面應用較廣的是色譜法和質譜法等相關檢測方法，其中色譜法又包括氣相色譜法、高效液相色譜法，高效液相色譜技術更為先進。同時，氣相色譜-質譜聯用技術將氣相色譜儀與質譜儀通過適當的接口相結合，借助計算機技術進行聯用分析，發(fā)展成熟，成為復雜組分分離和鑒定的有效方法。表4從樣品前處理、靈敏度、檢測周期、成本和檢測要求5 方面以質譜法和高效液相色譜法作為代表與LFCA作比較分析。分析表明，LFCA相較儀器分析化學技術，雖然檢測靈敏度低且不能進行定量分析，但其所需成本低、對技術人員要求不高、檢測時間短。因此，可以用LFCA法作為一種初篩手段，對陽性結果進一步使用儀器分析法得到準確數值。也可通過借助一些數據讀取設備對LFCA法進行半定量分析。

表 4 LFCA、質譜法、高效液相色譜法對比Table 4 Comparison of mass spectrometry, high performance liquid chromatography and LFCA

4.3 LFICA技術與其他免疫學檢測技術的對比

表 5 LFICA與其他免疫學檢測技術的對比Table 5 Comparison of LFCIA and other immunoassays

免疫學檢測技術是以抗原與抗體的特異性反應為基礎建立的，不同的檢測物質有其特異的抗原，并能激發(fā)機體產生相應的特異性抗體。基于免疫技術的檢測方法以目標菌的表面抗原或分泌毒素等為檢測靶點，因此是一種可用于檢測細菌或芽孢的方法。這種方法已廣泛應用于食品中致病菌的檢測，包括ELISA、免疫磁性分離技術、放射免疫分析技術、免疫熒光技術等。表5以這幾種方法為代表與LFICA作比較分析。分析表明，LFICA相較其他免疫學檢測手段，不需特定儀器或復雜技術手段輔助，節(jié)省成本，且對檢測環(huán)境要求不高，適合現場快速檢測。

4.4 LFCA試紙檢測技術與分子生物學檢測技術的對比

分子生物學檢驗技術是以核酸或蛋白質為分析材料，通過分析基因的結構、表達的變化和由此而導致的基因功能的改變，為疾病的研究和診斷提供更準確、更科學的信息和依據的一門技術。分子生物學檢測技術包括PCR技術、環(huán)介導恒溫擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術、生物發(fā)光檢測法等。表6以這幾種方法為代表與LFCA作比較分析[68]。分析表明，LFCA與分子生物學檢測技術相比，不需特定儀器及專業(yè)操作人員，檢測時間短，不易出現假陽性和假陰性。但該方法靈敏度偏低且不能實現定量檢測，是LFCA法的瓶頸問題，需要進行優(yōu)化和改進。

表 6 LFCA與分子生物學檢測技術的對比Table 6 Comparison of molecular biology techniques and LFCA

5 結 語

本文不僅研究總結了LFCA的背景、組成、原理、標記材料及其在人類醫(yī)學、動、植物醫(yī)學、環(huán)境監(jiān)測和食品檢測幾方面的應用現狀，還將LFCA與傳統(tǒng)檢測方法、儀器分析化學技術、免疫學檢測方法、分子生物學分析方法進行對比，總結其優(yōu)劣勢。

LFCA雖然不如儀器分析化學技術、免疫學檢測方法、分子生物學分析方法等的靈敏度高，而且不能定量檢測，但因其成本低、易操作、快速、便攜、干擾少、穩(wěn)定、結果肉眼可見、無需專業(yè)人員，適于現場檢測，仍被廣泛應用于醫(yī)學、食品、環(huán)境各領域。

LFCA目前已成熟應用在各領域的物質檢測中，但其靈敏度偏低、結果不能定量以及對標記材料和抗體的依賴性依然是該技術的瓶頸問題。如何解決以上問題，開發(fā)出一種基于LFCA基本原理，又無需納米顆粒等標記材料的高靈敏度、高準確性、高穩(wěn)定性的新型LFCA技術或許會成為未來LFCA研究的新突破。

2012年，Rohrman等[69]將LFCA與擴增和樣品制備技術相結合，達到對人類免疫缺陷病毒病毒的定量檢測，彌補了LFCA只可定性或半定量的不足。2015年，Jung等[39]將新的基因檢測技術-LAMP技術和LFIAC試紙檢測技術相結合，對流感病毒進行了檢測，結果顯示該技術可在40 min內完成基因擴增和LFICA檢測，且靈敏度達到10 拷貝，同時可實現現場檢測。隨著材料科學、電化學、廣電科學、基因擴增技術等的不斷發(fā)展及各學科的交叉融合，將會有更多的新型標記材料、抗體、檢測模式以及新型便攜化、微型化、自動化的定性、定量檢測儀器出現，可用于彌補現有LFCA的缺陷，使其在醫(yī)學、食品、環(huán)境各領域中發(fā)揮作用，為人類工作生活做出更大的貢獻。

綜上所述，LFCA的優(yōu)勢眾多，但靈敏度和定量問題亟待解決，隨著科技發(fā)展，LFCA還有很大的發(fā)展空間，值得廣大研究者們去努力探索挖掘。