HPLC法測定銀黃片中黃芩苷和綠原酸的溶出度

王敏 賀蕊 龔慕辛 關懷 于萍 賈富霞

摘要 目的：建立中藥銀黃片體外溶出度測定的實驗方法，為質(zhì)量控制提供重要指標和參數(shù)。方法：參考《中華人民共和國藥典》2015版收錄的溶出度測定方法第二法-槳法，采用HPLC法，用DAD檢測器，Agilent TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；流動相：A-0.1%磷酸水，B-0.1%磷酸乙腈，梯度洗脫；流速：1.0 mL/min；進樣量：10 μL；檢測波長為綠原酸327 nm，黃芩苷276 nm，測定自制銀黃片中黃芩苷和綠原酸的溶出度。結(jié)果：黃芩苷和綠原酸分別在0.1～20 μM和0.5～30 μM范圍內(nèi)線性關系良好（R2=0.9996）。HPLC法可同時測定中藥銀黃片中黃芩苷、綠原酸的溶出度。結(jié)論：本方法快速、靈敏、準確，重現(xiàn)性好，可用于銀黃片中綠原酸和黃芩苷的溶出度測定，為其質(zhì)量控制提供重要依據(jù)。

關鍵詞 銀黃片；黃芩苷；綠原酸；溶出度

Abstract Objective：To establish the determination method of baicalin and chlorogenic acid dissolution in Yinhuang tablets so as to provide criteria and parameters for the quality control of Yinhuang tablets. Methods：The dissolution of chlorogenic acid and baicalin from Yinhuang tablets was determined by HPLC method with DAD detector and Agilent TC-C18 column （250 mm ×4.6 mm， 5 μm） by using mixture of acetonitrile and purified water both containing 0.05% TFA as mobile phase with gradient elution in the current speed of 1.0 mL/min， and the detection wavelength of baicalin and chlorogenic acid were 276 nm and 327 nm， respectively. The dissolution test was operated according to the second dissolution method-oar method recorded on the Chinese medicine pharmacopoeia 2015 edition. Results：It was demonstrated that there was a good linear relationship in the range of 0.1-20 μM in baicalin and 0.5-30 μM in chlorogenic acid （R2=0.9996）， respectively. The dissolution of chlorogenic acid and baicalin from Yinhuang tablets could be determined at the same time by the same HPLC method. Conclusion：The HPLC method was rapid， sensitive， accurate， and reproducible. It could be used to determine the baicalin and chlorogenic acid dissolution in Yinhuang tablets and provide important references for the quality control of Yinhuang tablets.

Key Words Yinhuang tablets； Baicalin； Chlorogenic acid； Dissolution

中圖分類號：R284.1文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2017.02.043

銀黃片（自制）是由金銀花提取物和黃芩苷制備而成，具有清熱解毒、抗菌消炎作用，常用于治療急慢性扁桃體炎、急慢性咽喉炎和上呼吸道感染[1]。綠原酸是金銀花中主要的抗菌有效成分，常用作金銀花質(zhì)量控制的指標。黃芩苷含量是黃芩藥材的質(zhì)量評價指標，具有多種藥理作用。銀黃片（自制）的主要有效成分是綠原酸和難溶于水的黃芩苷，其溶出釋放性能對所其在體內(nèi)的吸收有較大的影響，是銀黃片能否起效的決定性因素。主成分或適宜物質(zhì)組的溶出度檢測，受到專家的重視，甚至有些專家建議將其作為中成藥質(zhì)量控制的項目[2-3]。為更好的控制藥品的質(zhì)量，避免紫外分光光度法中黃芩苷和綠原酸兩成分存在的相互干擾，本研究參考《中華人民共和國藥典》2015版一部0931溶出度測定方法第二法-槳法，采用高效液相色譜（HPLC）法，建立銀黃片（自制）中黃芩苷與綠原酸的溶出度測定方法，為其質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

1.1.1 儀器 Agilent 1100高效液相色譜儀，四元泵，自動進樣器，DAD檢測器，數(shù)據(jù)處理軟件；ZRS-8LD型智能溶出試驗儀（天津市天大天發(fā)科技有限公司）。

1.1.2 試藥 黃芩苷對照品（批號：110715-201318）和綠原酸對照品（批號：110753-201314），購自中國食品藥品檢定研究院；銀黃片（自制時間：20150609，規(guī)格：0.4047 g/片）；甲醇、乙腈均為色譜純，娃哈哈純凈水，磷酸（分析純），鹽酸（分析純）購于北京現(xiàn)代東方精細化學品有限公司，無水乙醇（分析純）購于現(xiàn)代東方（北京）科技發(fā)展有限公司。其余試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 HPLC檢測條件 色譜柱：Agilent TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：A-0.1%磷酸水，B-0.1%磷酸乙腈，按照表1的梯度進行洗脫；檢測波長：276 nm（黃芩苷），327 nm（綠原酸）；流速：1.0 mL/min；進樣量：10 μL。

1.2.2 黃芩苷、綠原酸混合對照品溶液的配制

精密稱取3.5 mg綠原酸，以50%甲醇溶解定容至10 mL，成濃度為1 mM的綠原酸母液。精密稱取4.4 mg黃芩苷，以70%甲醇溶解定容至10 mL，成濃度為1 mM的黃芩苷母液。上述樣品用鋁箔紙包好，置于4 ℃冰箱中待用。各取2種母液適量用50%的甲醇稀釋，制成含綠原酸、黃芩苷的系列混合對照品溶液，濃度見表2。

1.2.3 溶出度試驗與樣品溶液制備

按《中華人民共和國藥典》2015版一部0931溶出度測定方法第二法-槳法，以900 mL人工胃液作為溶出遞質(zhì)，進行溶出試驗。將900 mL已恒定至（37.0+0.5）℃的脫氣人工胃液置于溶出杯中，將精密稱重的6片樣品分別置于溶出杯中，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為100 r/min，在5、10、25、40、60、90、120和180 min定點取樣2.0 mL（隨即補充同溫度的遞質(zhì)2.0 mL），用0.45 μm的微孔濾膜過濾，濾液作為供試樣品溶液。同時取樣品10片，精密測定，求其平均片重，研細，精密稱取適量（相當于平均片重），置裝有900 mL人工胃液的1000 mL量瓶中，超聲30 min充分溶解，吸取2.0 mL，用0.45 μm的微孔濾膜過濾，濾液作為最大溶出度液。取各供試樣品溶液10 μL，按照“1.2.1”項下的色譜條件，測定黃芩苷、綠原酸的含量，計算每片的溶出度，求出平均溶出度。

溶出度=（C/C0）×（m平均/m）

其中，C-取樣樣品濃度；C0-平均片重的樣品濃度；m平均-平均片重；m-每片的片重。

1.2.4 方法學考察

1.2.4.1 專屬性試驗

對照品和樣品的HPLC圖譜如圖1所示，綠原酸和黃芩苷的分離度良好。

1.2.4.2 線性關系考察

將“1.2.2”項下的各濃度標準品溶液，按照“1.2.1”項下的色譜條件進行檢測，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標進行線性回歸，得到綠原酸（327 nm）的回歸方程Y=10.504x+1.8935（R2=0.9996）；黃芩苷（276 nm）的回歸方程Y=14.623x+12.618（R2=0.9996）。結(jié)果表明，綠原酸、黃芩苷分別在濃度0.5～30 μM，0.1 μM～20 μM線性良好。

1.2.4.3 精密度試驗

取“1.2.2”項下已配置好的對照品溶液3，按“1.2.1”項下各指標成分色譜條件，重復進樣5次，計算黃芩苷、綠原酸5次進樣峰面積的RSD值。綠原酸、黃芩苷的RSD分別為0.6%，1.2%，提示儀器精密度良好。

1.2.4.4 穩(wěn)定性試驗

取“1.2.3”項下的供試品溶液室溫下密封保存，于0、2、4、8、16 h取樣，按“1.2.1”項下各指標成分色譜條件進樣測定，計算各指標成分在各時間點峰面積RSD值，綠原酸、黃芩苷分別0.9%，1.5%，均低于3.0%，提示樣品溶液16 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

1.2.4.5 重復性試驗

按“1.2.3”項下溶出度供試品溶液（90 min）制備方法及樣品處理方法，重復制備5份樣品，按“1.2.1”項下各指標成分色譜條件進樣測定，計算黃芩苷、綠原酸在各時間點峰面積RSD值，綠原酸、黃芩苷分別為0.1%、0.6%，均低于2.0%，提示該方法的重復性良好。

2 結(jié)果

以“1.2.3”項下最大溶出度溶液中綠原酸和黃芩苷的含量測定結(jié)果為100%溶出，計算綠原酸和黃芩苷在各時間點的累積溶出率，并以溶出率為縱坐標，時間為橫坐標，繪制溶出曲線。綠原酸的溶出度曲線如圖2所示，在180 min基本都達到100%溶出。黃芩苷的溶出速率慢于綠原酸，在180 min時，僅達到65%（圖3）。

3 討論

用分光光度計對配制的綠原酸、黃芩苷對照品母液在200～400 nm波長掃描，結(jié)果顯示，綠原酸在327 nm波長處有最大吸收，黃芩苷在276 nm波長處有最大吸收，因此選擇327 nm為綠原酸的檢測波長，選擇276 nm為黃芩苷的的檢測波長，與文獻報道一致[4-5]。

本研究采用HPLC法同時測定了綠原酸和黃芩苷的含量，不僅方法簡便、可靠、靈敏度高、重現(xiàn)性好，而且避免了此前采用紫外分光光度法測定2種成分時相互間的干擾，使結(jié)果更精確、可靠。本研究發(fā)現(xiàn)銀黃片中黃芩苷溶出慢，在3 h尚未溶出完全，極有可能影響銀黃片藥效的發(fā)揮。因此，在自制銀黃片的處方設計時，應充分考慮輔料和工藝的選擇，以使其黃芩苷的溶出度符合要求，從而充分發(fā)揮銀黃片的藥效。

藥品溶出度試驗作為一種模擬固體口服制劑在胃腸道中崩解和溶出的體外試驗方法，通常被作為一種體外替代方法為體內(nèi)生物等效性研究和體內(nèi)外相關性研究提供信息和指導[6]。因此，溶出度試驗在藥物固體口服制劑的研發(fā)過程中具有重要的作用。隨著中藥現(xiàn)代化，中藥制劑質(zhì)量控制的理念和方法得到提升和發(fā)展。“固體制劑跟著溶出度走”，中藥固體制劑溶出度試驗已成為制藥工業(yè)必設的一個質(zhì)量控制項目，是評價制劑處方、生產(chǎn)工藝、制劑生物利用度的重要指標[7-10]。在中藥固體制劑生產(chǎn)中，為達到穩(wěn)定、安全、有效、可控，需要顛覆以往“重提取、重純化、重分離、輕成型”的思想，應以溶出度作為衡量手段，真正創(chuàng)造出質(zhì)量可靠、療效顯著的藥品。

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