芪山無糖顆粒對糖尿病前期大鼠瘦素和腫瘤壞死因子-α表達的影響

徐新鵬 朱嵐 魏燕 侯鵬超 李迎新 洪郁芝

糖尿病前期是指血糖水平介于正常值與糖尿病診斷標準之間的一種糖代謝異常狀態，糖尿病前期者是易發糖尿病的高危人群，絕大部分2型糖尿病患者被確診糖尿病之前都經過糖尿病前期階段。芪山無糖顆粒以健脾化濕、清熱瀉濁法立方，本科臨床應用于糖尿病前期和糖尿病早期已達十年之久，取得了較好的療效［1-2］。本研究在觀察糖尿病前期大鼠采用芪山無糖顆粒干預后糖脂代謝變化的同時，進一步檢測與胰島素抵抗相關的因子TNF-α和瘦素（Leptin）水平，旨在為芪山無糖顆粒的臨床應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 4周齡雄性SPF級SD大鼠60只，體重（100±20）g，由上海西普爾-必凱實驗動有限公司提供［SCXK（滬）2013-0016］。飼養于浙江中醫藥大學動物實驗研究中心［SCXK（浙）2008-0115］。通過杭州市中醫院動物護理和使用委員會審批。

1.2 實驗藥品 西藥馬來酸羅格列酮，由葛蘭素史克（天津）有限公司生產，規格4mg/片。中藥芪山無糖顆粒：由杭州市中醫院醫院制劑中心提供。配方：生黃芪746g、山藥373g、茯苓746g、黃芩225g、黃連150g、絞股藍373g、炒枳實300g、生山楂498g、川芎498g、葛根300g、蒼術300g。取處方量藥材，加水45L，煎煮2次，1h/次，合并煎液濃縮至含生藥1g/ml，冷藏過夜，離心。取上清液稀釋至含生藥0.4g/ml，加熱至60℃～70℃，加殼聚糖溶液（18g用2%醋酸溶液配成1%的濃度）1.8L，邊加邊攪拌，澄清劑加完后，繼續保溫攪拌30min，室溫放置過夜，離心，濾液濃縮，真空干燥成浸膏粉。加乳糖101.2g，甘露醇50.6g，糊精50.6g，用70%乙醇濕法制成顆粒，60℃干燥，整粒，制成1kg。

1.3 實驗儀器 血糖試紙及快速血糖儀均購自拜耳公司； AU2700全自動生化儀，日本OLYMPUS公司生產；Denley Dragon 酶標儀，美國Thermo Fisher Scientific公司生產。

1.4 實驗方法 高脂高糖飼料為普通飼料添加豬油、蛋黃粉、蔗糖、膽固醇加工后經過輻照消毒制作而成，其比例為普通飼料69.5%，豬油10%，蛋黃粉10%，蔗糖10%，膽固醇0.5%，由浙江省醫學科學院委托加工。芪山無糖顆粒（復方飲片顆粒劑）由杭州市中醫院中藥制劑室自主研發。大鼠的劑量約為人使用劑量的6.25倍，60kg成人服用芪山顆粒15g/d，換算成1kg大鼠的用量為30×1/60×6.25=1.5625g。60kg成人一天服用的最大量羅格列酮為8mg，換算成1kg大鼠用量為8×1/60×6.25=0.833mg。本實驗采用SD雄性大鼠，通過高脂高糖喂食制造糖尿病前期模型。普通飼料喂食2周適應環境后，隨機分成6組：正常對照組（NC）、高脂高糖喂食的模型組（MC）、低劑量中藥組（Z1）、中劑量中藥組（Z2）、高劑量中藥組（Z3）、羅格列酮組（X）。每組8只實驗用鼠，體重組間差異無統計學意義（P＞0.05）。NC組采用普通飼料喂食，MC、Z1、Z2、Z3、X組采用高脂高糖飼料喂食；16周后 MC、Z1、Z2、Z3、X比NC的體重和餐后2h血糖同時出現顯著性增高（p＜0.01），作為糖尿病前期造模成功。造模成功后，各組繼續原飼料喂養得同時，并予以藥物灌胃治療。NC、MC組采用蒸餾水2ml/d灌胃，Z1、Z2、Z3組分別使用中藥1.5625g/（kg·d）（等同于人的用量）、3.125g/（kg·d）（等同于人用量的 2 倍）、6.25g/（kg·d）（等同于人用量的4倍）灌胃，X組采用羅格列酮0.833mg/（kg·d）（相當于人的最大推薦劑量）灌胃。16周后行OGTT 試驗，即禁食不禁水12h，測定空腹血糖后，以2g/kg灌胃50%葡萄糖，再測餐后2h血糖。抽取尾靜脈血液用ELISA法檢測空腹胰島素和餐后2h胰島素。抽取大鼠腹主動脈血液待檢測血脂、TNF-α、leptin。其中血糖采用血糖試紙測量，測量之前以標準液校對。胰島素（INS）、TNF-α、leptin采用ELISA檢測法。血脂采用全自動生化儀檢測。根據公式HOMA-IS =1/（FPG×FINS）計算胰島素敏感性指數、根據公式HOMA-IR =FPG×Fins/22.5計算胰島素抵抗指數。

1.5 統計學方法 采用SPSS17. 0統計軟件包。計量資料以（）表示，組間比較采用t檢驗。p＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組別的Leptin、TNF-α及最后體重的比較 TNF-α結果提示，與NC組比較，MC組明顯升高（p＜0.01）；藥物組出現一定程度的恢復但不完全（p＜0.05或0.01）；與MC組相比，Z3、X組下降最為顯著（p＜0.01）；而 Z3、X 組組間比較比無意義（P＞0.05）見表1。

表1 各組別的Leptin、TNF-α及最后體重的比較（x±s）

2.3 對糖脂代謝及體重的影響 FPG及2hPG提示，與NC組比較，MC組血糖明顯增加（p＜0.01）；而藥物干預組出現血糖減低，但中藥組未能恢復正常對照組水平（p＜0.01）；與MC組比較，Z3、X組血糖明顯減低（p＜0.01），Z3、X 組效果優于 Z2（p＜0.05），Z3和X組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）（見表2）。TG結果提示，與NC組比較，MC組明顯增加（p＜0.01）；藥物組有一定下降，以Z3組最為明顯（P＞0.05）；與MC組比較，中藥、西藥組均出現顯著下降（p＜0.01）；與 Z1比 較，Z3降 低 TG效 果 最 佳（p＜0.01）；Z2、Z3、X組組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）（見表2）。LDL結果提示，與NC組比較，MC組明顯增加（p＜0.01）；藥物組出現不同程度的降低，以X組最為明顯（P＞0.05）；與MC組比較，中藥組均有下降，以Z3效果最為顯著（p＜0.05），X組效果顯著（p＜0.01）；Z3與X組之間差異無統計學意義（P＞0.05），見表2。

表2 各組別中血脂和血糖的比較

表2 各組別中血脂和血糖的比較

注：與NC組比較，*p＜0.05，#p＜0.01；與MC組比較，▲p＜0.05，△p＜0.01；與Z2組比較，★p＜0.05；與Z1組比較，■p＜0.01

組別 樣本量 TG（mmol/L） LDL（mmol/L） FPG（mmol/L） 2hPG（mmol/L）NC組 8 0.301±0.137 0.224±0.053 4.71±0.55 6.78±0.51 MC組 8 1.088±0.222# 0.534±0.132# 5.93±0.33# 8.88±0.43#Z1組 8 0.684±0.191#△ 0.553±0.197# 5.69±0.22# 8.54±0.85#Z2組 8 0.626±0.074#△ 0.469±0.071# 5.65±0.31# 7.8±0.53#△Z3組 8 0.438±0.155△■ 0.406±0.112#▲ 5.23±0.18#△ 7.19±0.43△★X組 8 0.523±0.187*△ 0.331±0.086△ 5.01±0.32△ 7.14±0.38△★

2.4 各組別中胰島素水平和HOMA指數的比較 HOMA-IR結果顯示，與NC組比較，MC組胰島素抵抗指數明顯增加（p＜0.01）；藥物組出現不同程度的降低，Z3、X組最為明顯（P＞0.05）；與MC組相比，Z3、X組顯著降低（p＜0.01）；而Z3與X組之間無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 各組別中胰島素水平和HOMA指數的比較

表3 各組別中胰島素水平和HOMA指數的比較

注：與NC組比較，*p＜0.05，#p＜0.01；與MC組比較，▲p＜0.05，△p＜0.01；與Z1組比較，■p＜0.05

組別 樣本量 FIN（mU/L） 2hFIN（mU/L） HOMA-IR HOMA-IS NC 8 3.4049±0.6526 2.0465±1.0044 0.7159±0.1747 1.4722±0.3682 MC 8 5.0866±0.7629# 5.5497±0.9865# 1.3376±0.1977# 0.761±0.1045△Z1 8 5.0522±0.653# 3.8867±0.9663#△ 1.2788±0.1865# 0.7973±0.1207*Z2 8 4.9564±0.3004# 3.8063±1.0854#△ 1.2429±0.0735# 0.807±0.0469*Z3 8 3.4993±0.6665△ 2.7281±0.9247△■ 0.8133±0.1597△ 1.2805±0.2987▲X 8 3.5385±1.0995△ 2.8144±1.0313△■ 0.8003±0.2951△ 1.4116±0.5191

3 討論

糖尿病前期主要病理生理特點是外周組織胰島素抵抗所導致的人體對葡萄糖的轉化利用和耐受性降低［3］。從中醫學角度而言，人體機能較大程度上取決于脾氣的運化功能。因脾為后天之本，氣血生化之源，與胃共同完成人體對飲食的消化和吸收過程。當人體先天不足，脾氣素虛而運化之力弱；或思慮或勞倦過度，脾氣滯結，或脾氣內耗，可致脾虛不運；或飲食失節，長期飲食肥甘，醇酒厚味，又乏運動，食熱內積，化火而耗水谷傷陰津。

芪山無糖顆粒由生黃芪、淮山藥、茯苓、蒼術、黃芩、黃連、絞股藍、炒枳實、生山楂、川芎、葛根等藥物組成。方中以生黃芪、淮山藥為君藥，補氣健脾培本；并臣以茯苓、蒼術滲濕燥濕，佐以黃芩、黃連、絞股藍清熱去濁；枳實、山楂理氣消食、化痰消積；川芎、葛根清熱生津、行氣活血。上方共奏益氣健脾、清熱化濕去濁之效，使脾氣健運而水津四布，痰濁內熱清而肥甘中滿消。在現代實驗及臨床研究中［4-6］，發現方中藥物通過眾多途徑發揮降糖降脂，增加胰島素分泌及敏感性，改善胰島功能等作用。

本實驗中，經高脂飼料喂食后的大鼠與正常喂食后的正常大鼠比較，在體重和血脂明顯升高的同時，血糖較正常對照組明顯升高，但尚未達到通常STZ誘導的典型糖尿病大鼠模型（血糖＞16.7mmol/L）的標準。并且，血漿胰島素水平較正常大鼠明顯升高，胰島素抵抗指數升高，胰島素敏感指數下降。因此，本實驗高脂飼料喂食后的大鼠基本符合2型糖尿病前期的大鼠模型。

本研究結果顯示，芪山無糖顆粒與羅格列酮均能不同程度降低模型組的空腹血糖及餐后2h血糖，明顯改善脂代謝紊亂。且與羅格列酮對照組比較，芪山無糖顆粒更有干預體重增加的優勢。而且，在糖脂代謝改善的同時，空腹胰島素和餐后2h胰島素均下降，胰島素抵抗指數（HOMA-IR）在中藥各劑量組和羅格列酮組也隨之下降，胰島素敏感指數（HOMA-IS）均升高。表明芪山無糖顆粒能明顯改善糖尿病前期大鼠模型的血糖水平和脂代謝紊亂，而糖脂水平的改善是與降低2型糖尿病主要病機，即胰島素抵抗程度相關。

脂肪組織是一個重要的內分泌器官，其可以分泌多種脂肪因子如TNF-α、leptin等。研究發現［7］，TNF-α在肥胖鼠脂肪細胞中的過度表達和胰島素受體的酪氨酸激酶活性增加，導致胰島素抵抗。另外，TNF-α可通過抑制脂蛋白脂酶（LPL）活性，促進脂肪細胞內脂肪分解而升高FFA，加重胰島素抵抗。本研究結果表明，芪山無糖顆粒使糖尿病前期大鼠增高的TNF-α有一定程度的下降。

肥胖者leptin血漿含量及脂肪組織表達量均增加。體外研究表明，脂肪細胞體積與數目的增加與leptin、TNF-a的表達水平呈正相關，存在leptin抵抗及TNF-a抵抗狀態［8］，反饋性的增加其表達和分泌，可促進體重增加。Leptin可進一步抑制胰島素信號轉導途徑，加重胰島素抵抗。本研究結果顯示，MC組經芪山無糖顆粒干預后，增高的Leptin呈劑量依賴性的下降。

綜上所述，芪山無糖顆粒可能是通過降低糖尿病前期大鼠TNF-α和leptin水平的作用機制，從而達到緩解糖尿病前期大鼠高胰島素血癥，增加糖尿病前期大鼠胰島素敏感性，最終實現糾正糖尿病前期大鼠的糖代謝及脂代謝紊亂的作用。