多重熒光RT-PCR快速檢測手足口病病原體的結果分析

沈偉鋒 邵平揚 殷新光 鄒洪興 呂青山 楊清萍

根據世界衛生組織調查，手足口病（HFMD）已成為亞洲最常發生的傳染病之一，＜5歲兒童是主要患者。因其傳染性強、病死率高，已經連續5年成為我國發病率最高的傳染病之一。2015年12月，國家食品藥品監管總局批準了首個EV71型滅活疫苗的生產注冊申請，并于2016年3月18日正式上市［1］。臨床試驗顯示，EV71疫苗對EV71感染HFMD的保護效力＞90%，但受樣本數量限制，對EV71感染所致重癥病例的保護效力以及免疫的持久性等缺乏準確評估，對CA16感染和其他腸道病毒感染的HFMD無保護作用［2-3］。因此，HFMD疫情的防控任務依然嚴峻，對HFMD病原體快速檢測及分型有利于HFMD的早期診斷和治療，也是危重病例救治的關鍵。本研究采用自建的多重熒光RT-PCR方法對HFMD患者腸道病毒進行分型檢測，并對2017年嘉興地區HFMD的病原學類型及流行特征進行分析。現報道如下。

1 臨床資料

1.1 一般資料 收集2017年1月至12月嘉興市第一醫院感染科就診的HFMD患兒743例，其中男435例，女308例；年齡4個月～13歲，中位年齡34個月，HFMD臨床診斷標準依據衛生部頒布的《HFMD診療指南》（2010年版）［4］。HFMD納入標準：（1）臨床癥狀表現為手、足、口腔等部位的斑丘疹、皰疹，伴或不伴發熱。（2）病程1～5d初次就診，未經抗病毒治療的急性期患兒。（3）腸道病毒通用型（EV）核酸檢測陽性。（4）重癥病例出現神經系統受累癥狀，表現為精神差、嗜睡、易驚、頭痛、嘔吐、譫妄、昏迷、肢體抖動、肌陣攣、眼球震顫、共濟失調、眼球運動障礙、無力或急性弛緩性麻痹、驚厥等，體格檢查可見腦膜刺激征、腱反射減弱或消失，巴賓斯等病理征陽性［4］。

1.2 方法 （1）標本采集與處理：每例患者均留取急性期咽拭子樣本1份，用病毒專用采樣管采集，-70℃低溫保存，用于腸道病毒核酸檢測。（2）儀器與試劑：GenBank數據庫中下載不同年份和地區EV的5’端非編碼區基因序列、EV71和CA16的VP1區基因序列，引物與探針委托上海基康生物工程有限公司合成；熒光定量PCR儀為美國AB公司ABI7500。病毒RNA提取試劑Qiagen QIAamp Viral RNA Mini Kit購自德國Qiagen公司；Real Time PCR Kit購自TIANGEN，嚴格按照試劑盒說明書操作提取病毒RNA。（3）腸道病毒核酸檢測：采用課題組建立的多重熒光RT-PCR方法對HFMD患者腸道病毒進行分型檢測［5］，每份標本同時進行腸道病毒通用型、腸道病毒71型（EV71）和柯薩奇病毒A16型（CA16）核酸及非競爭性內標檢測。PCR擴增反應條件為：50℃20min，1個循環；95℃15min，1個循環；94℃ 15s，56℃45s，45個循環。在每個循環退火溫度時進行熒光采集，共選用FAM、ROX、VIC和CY5四通道進行檢測。（4）多重熒光RT-PCR檢測結果分析：課題組建立多重熒光RTPCR方法，由于引入了非競爭性內標檢測，可監測標本檢測的假陰性反應，為臨床HFMD樣本檢測的準確性提供了保證。根據PCR檢測的原理，將Ct≤38判斷為陽性結果；內標CY5通道出現特異性擴增熒光信號，則該標本檢測結果有效。判斷EV71或CA16陽性必須同時EV陽性。結果解釋參照《HFMD預防控制指南》（2008 年版）［6］。

1.3 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件。計數資料組間比較采用χ2檢驗，p＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 RT-PCR檢測腸道病毒EV71型和CA16型核酸結果 743例HFMD患者中，EV71型腸道病毒感染176例，占23.7%；CA16型腸道病毒感染155例，占20.8%；非EV71非CA16型腸道病毒感染410例，占55.2%；EV71/CA16混合感染型2例，占0.3%。743例HFMD患者中，重癥HFMD患者114例，占15.3%，普通HFMD患者629例，占84.7%；重癥HFMD組以腸道病毒EV71型感染為主，占78.1%（89/114），而普通HFMD組腸道病毒EV71型感染僅占13.8%（87/629），兩組之間不同類型腸道病毒感染人數構成比，差異具有統計學意義（χ2=235.939，P=0.00）。見表1。

表1 重癥HFMD與普通HFMD患者腸道病毒核酸檢測結果［n（%）］

2.2 743例HFMD患者病原體感染季節分布 2017年1～12月共采集到EV陽性的HFMD病例743例，不同季度感染分布不一，其中二、三季度為全年發病高峰期，腸道病毒檢出率達81.0%，尤以二季度腸道病毒感染檢出率最高，占全年的52.2%；非CV71非CA16型EV陽性病例在全年各季度的檢出率均高于CV71型和CA16型。HFMD在不同季節之間，不同類型腸道病毒感染的人數分布比較，差異無統計學意義（χ2=18.159，P=0.033）。見表 2。

表2 743例HFMD患者不同腸道病毒感染時間分布及分型結果（n）

2.3 不同性別間HFMD患兒感染不同腸道病毒的構成比 743例HFMD患兒中，不同性別感染不同類型腸道病毒的人數分布見表3。經統計學分析，被不同類型腸道病毒感染的人數分布在性別之間，差異無統計學意義（χ2=0.602，P=0.896）。

表3 743例HFMD患兒腸道病毒感染性別分布［n（%）］

2.4 HFMD患者病原體感染年齡分布 743例HFMD患兒中，0～5歲感染兒童占88.6%，≥6歲感染兒童占11.4%。HFMD患者不同腸道病毒類型年齡分布見表5。

表 5 743例HFMD患者病原體感染年齡分布（n）

3 討論

HFMD是兒童常見傳染病，由多種腸道病毒感染引起，臨床癥狀表現輕重不同，大多數患兒癥狀輕微，預后良好；少數重癥病例可并發病毒性腦炎、急性弛緩性麻痹、神經源性肺水腫、心肌炎，甚至危及生命。對HFMD病原體快速檢測及分型有利于HFMD的早期診斷和治療，也是危重病例救治的關鍵［7］。目前，HFMD病原學的實驗診斷方法主要有免疫學方法進行腸道病毒特異性抗體檢測和熒光RT-PCR進行病毒核酸檢測，前者因方法學的局限性，僅限于腸道病毒EV71、CA16分型，且易出現假陽性結果，無法對非EV71非CA16型腸道病毒的分型鑒定和早期診斷。實時熒光RT-PCR法因具有較高的靈敏度和特異性，已成為HFMD病原學分型檢測的金標準［8］，但臨床實際工作中因標本采集、污染、RNA抑制物等因素，無法檢測結果的假陰性，且對于大批量標本的檢測費時費力。本研究采用含非競爭性內標檢測的多重熒光RTPCR方法，能夠一管同時檢測腸道病毒通用型、EV71型和CA16型，并對假陰性結果進行有效的監控，彌補了其他方法學的不足。

本資料中743例HFMD患兒，EV71型腸道病毒感染176例，占23.7%，CA16型感染155例，占20.9%，EV71型與CA16型混合感染2例，占0.3%，其余410例HFMD為非EV71非CA16型腸道病毒感染，占55.1%，提示本地區HFMD病原體感染流行毒株可能存在多樣性，或有其他腸道病毒的感染流行毒株，有必要進一步明確非EV71非CA16型腸道病毒的類型，并加強監控。114例重癥HFMD患者中，EV71型、CA16型和非EV71非CA16型腸道病毒所占比例分別是78.1%，9.6%和10.5%；629例普通HFMD患者中EV71型、CA16型和非EV71非CA16型的腸道病毒所占比例分別是13.8%，22.9%和63.3%，可見EV71型腸道病毒在HFMD重癥病例中仍占主導優勢，但臨床亦不可忽視非EV71非CA16型的其他腸道病毒在HFMD患兒，尤其是重癥病例中的檢出情況。

隨著EV71型滅活疫苗的批準上市和臨床應用以及國家對HFMD控制與預防工作的宣傳與干預，各地HFMD的流行特征亦發生演變，部分地區非EV71非CA16型腸道病毒感染比例逐年上升。本資料在總結2017年HFMD患兒流性特征的基礎上，發現HFMD非EV71非CA16型腸道病毒感染占較高比例，達到55.1%。進一步比較分析743例HFMD患兒的臨床分布，發現本地區HFMD各季度感染分布不一，流行特征表現為夏秋兩季高發，HFMD發病人數占全年的81.0%，非CV71非CA16型腸道病毒感染病例的檢出率均高于CV71型和CA16型，可能存在其他腸道病毒優勢型別，需引起重視；743例HFMD患兒中，不同類型腸道病毒感染的人數分布，在性別上無差異，表明不論性別，HFMD的發病概率相似；對HFMD發病患兒年齡分布特征分析發現，HFMD發病以嬰幼兒（＜6歲）為主，占88.6%，符合HFMD的流行特征。

綜上所述，HFMD作為一種高發幼兒傳染病，嘉興地區EV71型腸道病毒仍然是重癥HFMD的主要流行毒株，但HFMD的腸道病毒感染流行特征不一，臨床亦不可忽視HFMD非EV71非CA16型腸道病毒感染流行的監控，有必要進一步明確類型，為臨床診療與疾病防控提供信息。