TNIP1基因rs7708392多態性與動脈粥樣硬化相關性研究

于建忠

腦卒中是一種嚴重危害國內外中老年人的常見病，它具有發病率高、死亡率高、致殘率高和復發率高等特點，既往發病機制的研究表明，腦卒中與遺傳因素密切相關，而動脈粥樣硬化又是腦卒中最常見的原因之一。TNFα誘導蛋白3相互作用蛋白1（TNFα -induced protein 3-interacting protein 1，TNIP1），又稱為A20結合核因子κB抑制蛋白1（ABIN1），可與多種受體結合，如腫瘤壞死因子（TNFα）、上皮生長因子（EGFR）、TOLL樣受體、過氧化物酶體增殖激活受體（PPAR）等，是一種炎癥調節因子，而炎癥反應在動脈粥樣硬化的發生發展中起著決定性作用，類風濕關節炎和系統性紅斑狼瘡的患者中，這種炎癥反應尤其明顯，并且可能導致該類患者的心血管疾病死亡率增高[1-2]，因此，TNIP1可能通過參與炎癥反應而導致動脈粥樣硬化的發生發展。本研究擬探討TNIP1基因rs7708392多態性與動脈粥樣硬化發生風險的相關性。

1 資料與方法

1.1 研究對象 包括腦卒中高危人群和健康體檢人群，依據國家衛生部《2013年腦卒中高危人群篩查和干預項目技術方案》的參考標準，自2014年5月—2017年8月，以海南省內的鄉鎮社區常住人口作為腦卒中高危人群的篩查對象，選定海南省文昌市及海口市得勝沙社區作為篩查地區，所有入組人群均為漢族人，年齡≥40歲常住人口作為篩查對象，根據腦卒中高危人群篩查和干預工作流程，依據以下危險因素進行風險評估：（1）高血壓病史（≥140/90mmHg）或正在服用降壓藥；（2）房顫或明顯的脈搏不齊；（3）吸煙；（4）血脂異常或未知；（5）糖尿病；（6）日常很少的體育運動（體育鍛煉的參照準則是每周鍛煉大于3次、每次大于30分鐘、持續時間不少于1年；從事中重度體力勞動者視為經常有體育鍛煉）；（7）明顯超重或肥胖（BMI≥26kg/㎡）。凡符合以上任意3條，則判定為腦卒中的高危人群。

經醫院倫理委員會同意自2014年9月—2017年8月期間，在湘雅附屬海口醫院體檢中心內科診室收集健康人群的樣本，采集參與者周圍靜脈血，同時，詢問病史，收集相關的指標，包括年齡、性別、血壓、吸煙飲酒情況、家族史等。

入組標準：（1）入組者必須為本地籍貫且長期居住漢族人，相互之間無血緣關系；（2）自愿入組者經現場咨詢同意后簽訂知情同意書，并符合入組及排除標準的體健者判定為健康組研究人群；（3）所有入組者必須具備頸部血管B超檢查。

排除標準：（1）外地籍貫及本省籍貫但不在此居住者；（2）既往無心腦血管病病史；（3）無嚴重的心肝腎疾病史；（4）無全身免疫系統疾病，如系統性血管炎、系統性紅斑狼瘡、結締組織病史；（5）無心臟病史，如冠心病、心力衰竭等；（6）無癌癥病史。

根據頸部血管彩超檢查有無動脈粥樣硬化分為病例組和對照組。檢查提示具有內膜增厚、血管斑塊或血管狹窄者歸入病例組；頸部動脈血管無動脈粥樣硬化表現為對照組。

對所有符合條件的入組者，在入組的當天或次日清晨空腹狀況下，采集3～5ml周圍靜脈血，放置在EDTA抗凝試管中，置于-20℃冰箱中暫時儲存，分批次集中提取樣本DNA，以備后期進一步研究。

1.2 主要試劑和儀器 GoldMag-Mini全向基因DNA純化試劑盒（117883）和Sequenom公司iPLEX Gold試驗技術，試劑包括：進口純凈水、PCR Buffer（10×）、MgCl2（25mM）、iPLEX Buffer（10×）、dNTP mix（25mM）、iPLEX 酶、Hotstar Taq（5U/μL）、Termination mix、SAP 酶 （1.7U/μL）、SAP Buffer（10×）、SpectroCLEAN 樹 脂 。GeneAmpPCR System9700 PCR儀、NanoDrop2000分光光度儀、MassARRAY質譜儀。

1.3 方 法

圖1 rs7708392位點的基因分型圖

1.3.1 DNA提取 使用西安金磁納米生物技術有限公司生產的GoldMag-Mini全血基因組DNA純化試劑盒（批號117885）進行樣本DNA的提取純化，嚴格按照廠家說明書進行操作提取全血DNA。并對所得到的DNA采用NanoDrop2000分光光度計測定其濃度及純度。只有DNA濃度和純度都在允許范圍內的樣品，才可作為合格樣品用于下一步的實驗。

1.3.2 引物設計與合成 引物設計主要是使用Sequennom MassARRAY Assay Design 3.0 software軟件，通過該軟件對所選位點進行引物及單堿基延伸引物的設計。rs7708392的引物位點如下：1st-PCR引物：ACGTTGGATGAGGCCAACTGGTCAATTCTC；2nd-PCR引物：ACGTTGGATGGGGTCTCTTCTGGAACTT AG；UEP 序列：ggggaTGGAACTTAGTAGACTAGTCA

1.3.3 基因分型 本實驗采用Sequennom MassARRAY分子量陣列技術對所選擇的位點進行分型，即將 MassARRAY iPLEx（sequelloin，SanDiego，CA）的分型平臺與時間飛行質譜生物芯片系統（MassARRAY sequenom SNP）相結合的方法。分型步驟：PCR擴增反應以延伸基因位點兩端的序列；SAP酶處理以降解擴增用的dNTP；延伸引物進行單堿基延伸反應；樹脂除鹽純化；上機點樣；MassARRAY Analyzer Compact質譜檢測，根據質譜峰的位置確定分子質量，進行基因分型（圖1）。基因位點分型依據：第一條紅色虛線為UEP的分子量，第二條紅/藍色虛線為UEP+G堿基的分子量，第三條紅/藍色虛線為UEP+C的分子量。若第三條線處出峰，則為CC型純合子。若第二條線處出峰，則為GG型純合子。兩條線處均出峰，則為GC雜合子。

1.4 統計學方法 應用SNPStats在線軟件（https://www.snpstats.net）進行數據分析。（1）研究對象的一般資料分析：計量資料采用T檢驗，計數資料采用χ2檢驗；（2）哈迪-溫伯格平衡檢驗：計算對照組中基因位點的基因型及等位基因頻數，并認為對照組中最小的等位基因頻率作為風險等位基因。然后，采用卡方檢驗對對照組內基因位點的平衡性進行檢驗，若P＞0.05，則說明滿足哈迪-溫伯格平衡，相反，若P＜0.05，則表明所選取的樣本未達到隨機平衡狀態，不具有群體代表性。（3）疾病風險的關聯分析：測定基因型與疾病風險之間的關系[4]。

2 結果

2.1 臨床資料比較 本研究共納入病例組264例，其中男性 110例，女性 154例，年齡（65.15±10.87）歲，對照組320例，其中男性148例，女性172例，年齡（65.69±10.77）歲，兩組之間在年齡、性別、吸煙史、甘油三酯（TG）、總膽固醇（TCHO）、低密度脂蛋白（LDL）的比較差異無統計學意義（P＞0.05）。病例組高密度脂蛋白（HDL）高于對照組（P＜0.01）。見表 1。

2.2 哈迪-溫伯格平衡檢驗 該位點在兩組中的基因型頻率符合哈迪-溫伯格平衡檢驗（P＞0.05）。兩組人群最小等位基因頻率比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.3 基因模型比較 在矯正年齡、性別的情況下，計算各個模型下的優勢比（OR）和95%的可信區間（95%CI）。兩組間所有基因模型下差異均無統計學意義（P＞0.05），見表 2。

在男性亞組中，rs7708392在顯性模型、加性模型及雜合子情況下增加動脈粥樣硬化的發病風險（P＜0.05）；而在女性亞組中，該變異在任何模型下差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表 3、4。

3 討論

目前，TNIP1基因變異與腦血管病風險相關性的研究鮮有報道，我們的前期研究發現，TNIP1基因rs7708392位點可能增加動脈粥樣硬化性腦梗死的發病風險[5]。那么，rs7708392與動脈的粥樣硬化之間是否具有相關性，本研究發現在整體分析中該變異在等位基因以及五種遺傳模型下與動脈粥樣硬化的風險無統計學意義。在亞組分析時，男性亞組人群中，該位點在顯性、加性及雜合子模型下增高動脈粥樣硬化的發病風險（P＜0.05）。

表1 病例組與對照組臨床資料比較（%±s）

表1 病例組與對照組臨床資料比較（%±s）

注：TG：甘油三酯；TCHO：膽固醇；HDL：高密度脂蛋白；LDL：低密度脂蛋白

組別對照組病例組P值例數320 264年齡（歲）65.69±10.77 65.15±10.87 0.55性別（女）[例（%）]172（53.75）154（58.33）0.27吸煙[例（%）]45（14.06）29（10.98）0.27 TG（mmol/L）2.13±1.34 2.01±1.21 0.26 TCHO（mmol/L）5.69±1.04 5.73±1.14 0.71 HDL（mg/dL）1.36±0.36 1.54±0.50＜0.01 LDL（mg/dL）3.68±0.90 3.74±0.88 0.37

表2 rs7708392多態性與動脈粥樣硬化風險相關性

表3 男性亞組rs7708392多態性與動脈粥樣硬化風險相關性

表4 女性亞組rs7708392多態性與動脈粥樣硬化風險的相關性

TNIP1基因位于人染色體5q32～q33.1，其中外顯子18個，該基因所編碼的A20結合核因子κB抑制蛋白1（ABIN1），ABIN1與其配體A20蛋白結合并相互作用，可以下調NF-κB病理通路的活性[6]。TNIP1基因過表達還可以通過抑制腫瘤壞死因子α（TNFα）而抑制 NF-κB 的活性[7]。TNIP1 基因多態性可能通過影響基因表達或功能引起NF-κB病理通路異常，從而誘導炎癥相關疾病的發生。亦有動物模型研究[8]發現小鼠模型血管內皮功能失衡和心肌的肥厚，ABIN1參與慢性炎癥與心血管疾病的發生。所以，TNIP1在炎癥、血管內皮細胞功能、心腦血管病的發生等方面起著重要作用。

目前，關于TNIP1基因變異的研究，主要集中在自身免疫性疾病如銀屑病、系統性紅斑狼瘡、類風濕關節炎的人群中，并且該基因的突變可增加系統性紅斑狼瘡的患病風險[9-10]。rs7708392研究也以系統性紅斑狼瘡為主，雖然該變異位點存在遺傳異質性，有種族或地域的差異性，歐洲人群G等位基因頻率（約70%）顯著高于亞洲人群（約30%），但是，多項研究[11-13]證實該位點確實增加中國漢族、歐洲及日本人群紅斑狼瘡的風險。一項納入12篇研究的Meta分析[14]提示該位點增高紅斑狼瘡的發病風險，但是，他們的研究結論顯示C等位基因頻率增高發病風險。本研究顯示，雖然該變異在總體分析時兩組間未見顯著性差異，但在男性亞組分析時發現GC基因型、加性模型和顯性模型都可能與動脈粥樣硬化的風險相關。由此可見，該基因變異在紅斑狼瘡和動脈粥樣硬化或動脈粥樣硬化性腦梗死中發揮著重要作用，但是，具體的致病機制有待進一步研究。

本研究存在一些不足：（1）本次研究中，動脈粥樣硬化的界定主要依據頸部血管彩超檢查，部分病例可能有其他部位的動脈粥樣硬化，從而造成分組的錯誤；（2）由于樣本量有限，尤其是在亞組分析時，因此有待進一步增加樣本量進行驗證；（3）由于僅僅對單個位點進行關聯分析研究，基因-基因交互作用研究仍有待進一步開展。（所有數據由本人在中南大學湘雅醫學院讀博期間于附屬海口醫院采集完成。）