解毒化濁方誘導HER-2陽性乳腺癌SK-BR-3細胞凋亡的研究

谷煥鵬 胡升芳

乳腺癌是高度異質性的惡性腫瘤，HER-2陽性乳腺癌，惡性程度高、生存率低、病情進展迅速、易發生轉移、預后差[1]。HER-2陽性乳腺癌西醫治療以單克隆抗體曲妥珠單抗為主，其顯著降低HER-2陽性乳腺癌死亡率[2]，將疾病無進展生存期延長12.6周[3]，但25%患者出現心臟毒性[4]?！敖舛净瘽岱健笔潜菊n題組總結多年臨床經驗方，用于治療HER-2陽性乳腺癌，取得較好的療效，具備一定的理論和臨床療效基礎[5-6]。本實驗通過“解毒化濁方”中藥干預乳腺癌細胞，探討中藥誘導乳腺癌細胞凋亡的作用機制。

1 實驗材料

1.1 動物及細胞株 雌性Wistar大鼠，SPF級,體質量200±20g，購自浙江中醫藥大學動物實驗中心，動物合格證號：SCXK（滬）2012-0002。人乳腺癌細胞株SK-BR-3細胞（中國科學院上海細胞研究所編號TCHu225）。

1.2 藥物及試劑 “解毒化濁方”由蛇六谷、懷牛膝、半枝蓮各30g，黃芪15g，白術 9g，茯苓12g組成。以上中藥飲片均由浙江中醫藥大學附屬醫院中藥房提供（批號151102），按傳統煎煮方法制成中藥水煎劑，濃縮為3.2g/mL（含生藥量）。HER-2抑制劑Mubritinib（TAK-165）（MCE 公司，批號 15426）；DMEM 培養基（美國Gibco公司，批號1801040206）；胎牛血清（美國 Gibco 公司，批號 10099141）；Annexin V/PI（美國BD 公司，批號 6301518）。

1.3 儀 器 流式細胞儀（FC500），美國BECKMAN公司；CO2培養箱（3111），美國 THERMO FISHER；熒光倒置顯微鏡（IX70-S8F），日本奧林帕斯公司，日本三洋電器有限公司；超凈工作臺（SW-CJ-1FD），蘇州安泰空氣技術有限公司。

2 實驗方法

2.1 動物分組及劑量設置 將8只雌性Wistar大鼠隨機分為對照組、中藥組（解毒化濁方組）、西藥組（HER-2抑制劑組）、聯合組（解毒化濁方+HER-2抑制劑組），每組2只。按“實驗動物與人的體表面積比”中人鼠等效藥量換算方法計算給藥劑量，中藥給藥劑量18.8g/（kg·d）（均為生藥量）。中藥組大鼠給予解毒化濁方水煎劑灌胃，每天2次，每次3mL/只；對照組大鼠等量生理鹽水灌胃，每天2次，每次3mL/只；西藥組大鼠給予HER-2抑制劑Mubritinib（灌胃），每天2次，每次2mg/只；聯合組大鼠給予解毒化濁方水煎劑灌胃每次3mL/只，Mubritinib每次2mg/只，每天2次。

2.2 動物采血及含藥血清制備 給藥連續3天后，當夜禁食不禁水，第4天給藥1次，各給藥組在末次給藥后1h腹主動脈采血，將血液注入無菌試管，加蓋。無菌分離血清，離心，3000r/min，5min。同組混合以消除個體差異，用0.22μm的濾膜過濾，56℃，30min水浴滅活，-20℃保存備用。

2.3 SK-BR-3細胞培養、細胞接種及給藥方法人乳腺癌細胞株SK-BR-3細胞用DMEM培養液培養，加入15%胎牛血清、1%青霉素與鏈霉素，37℃，5%CO2及飽和濕度培養。5d傳代1次，將對數生長期的細胞以培養液調成1×105/mL，接種于6孔培養板上，200μL/孔，每組3孔，加入占培養基終濃度20%的含藥血清，按實驗設計分組為對照組、中藥組、西藥組、聯合組,分別加藥處理，在常規條件下培養，分別干預細胞24h和48h后流式儀檢測。

2.4 AnnexinV-FITC/PI法流式檢測細胞凋亡 將含藥血清作用SK-BR-3細胞后，用胰蛋白酶消化,并用磷酸鹽緩沖液洗滌,將待測細胞數調整為5×105/mL，離心15min，棄上清液，PBS洗滌，將細胞重懸于binding buffer 300μL，加入 Annexin V-FITC 10μL，輕輕搖勻，室溫反應1h，加入PI 5μL，輕輕搖勻，室溫反應放置15min，在流式細胞儀上進行檢測，分析細胞凋亡率。

2.5 統計學方法 應用SPSS19.0軟件進行統計分析，實驗數據以均數±標準差（±s） 表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 解毒化濁方給藥血清作用24h對人乳腺癌細胞株SK-BR-3細胞凋亡的影響 中藥組與對照組比較早期、晚期凋亡率、總凋亡率增加，差異無統計學意義（P＞0.05）；西藥組、聯合組與對照組比較早期凋亡率、總凋亡率明顯增加，差異有統計學意義（P＜0.05）；各組之間晚期凋亡率差異不明顯（P＞0.05）。見表 1、見圖 1（封四）。

3.2 解毒化濁方含藥血清作用48h對人乳腺癌細胞株SK-BR-3細胞凋亡的影響 與對照組比較，各用藥組早期凋亡率明顯增加（P＜0.05）；與對照組比較，西藥組、聯合組細胞凋亡率、總凋亡率明顯增加（P＜0.05）；中藥組與對照組比較晚期凋亡率、總凋亡率增加，差異無統計學意義（P＞0.05）；西藥組與聯合組比較早、晚期凋亡率、總凋亡率變化不明顯，差異無統計學意義（P＞0.05）。干預細胞48h與24h后比較，西藥組、聯合組較中藥組晚期細胞凋亡率明顯增加（P＜0.05）。見表 2、見圖 2（封四）。

表1 解毒化濁方含藥血清作用24h對人乳腺癌細胞SKBR-3細胞凋亡的影響（%，±s）

表1 解毒化濁方含藥血清作用24h對人乳腺癌細胞SKBR-3細胞凋亡的影響（%，±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05

組別對照組中藥組西藥組聯合組孔數3333早期凋亡率1.03±0.23 2.43±0.33 4.76±0.63*6.93±0.76*晚期凋亡率1.50±0.34 2.33±1.09 2.23±1.13 2.23±1.13總凋亡率2.53±0.42 4.76±1.41 7.00±1.75*9.93±0.28*

表2 解毒化濁方含藥血清作用48h對人乳腺癌細胞SKBR-3細胞凋亡的影響（%，±s）

表2 解毒化濁方含藥血清作用48h對人乳腺癌細胞SKBR-3細胞凋亡的影響（%，±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05

組別對照組中藥組西藥組聯合組孔數3333早期凋亡率1.60±0.10 4.76±0.23*8.56±0.64*6.80±0.10*晚期凋亡率1.93±0.20 4.40±0.32 32.90±2.00*22.86±9.74*總凋亡率3.53±0.13 9.16±0.21 41.46±1.93*34.83±6.51*

4 討論

元·朱丹溪《丹溪心法·赤白濁》認為，“濁主濕熱、有痰、有虛”，故治濁當補虛清化，方從法立，根據健脾除濕化濁法，結合臨床體質調查和癥藥數據挖掘，從本課題組前期已完成乳腺癌術后診療規律研究挖掘數據，選出最能體現療效的用藥頻次最高的六味藥組成的聚類方“解毒化濁方”。方中出現頻次，懷牛膝（1116次）、蛇六谷（1073次）、半枝蓮（1041次），黃芪（1082次）、白術（1179次）、茯苓（1179次）。解毒化濁方中的六味藥從邪之初、已成、熱結等三個層面，通過表托、內利兩條途徑化解濁毒[7]，解毒化濁方尤其適用HER-2陽性乳腺癌術后的治療。

本課題組根據HER-2陽性乳腺癌脾虛濁毒易生的病機特點，在觀察臨床乳腺癌高危人群血漿凋亡相關基因產物變化的基礎上[8]，進一步開展了中藥調控乳腺癌細胞HER-2過表達后對PI3K/Akt通路的影響，研究[9]結果發現，乳癌術后方血清干預人乳腺癌細胞株MDA-MB-453細胞，用藥各組p-Akt蛋白表達含量均較對照組明顯降低，表明用藥組能夠通過抑制Akt蛋白的磷酸化水平發揮抗乳腺癌的作用。藥物干預細胞后，可以通過調控HER-2受體家族及其下游信號PI3K/Akt轉導通路以及改變調亡相關蛋白。前期研究發現解毒化濁方具有抑瘤作用，其作用機制有待于進一步探討。

細胞凋亡是程序性的細胞死亡，能否誘導腫瘤細胞凋亡成為當今藥物治療腫瘤效果的判定標準之一[10]。本實驗結果發現，解毒化濁方中藥血清干預SK-BR-3細胞24h后，各用藥組與對照組比較早期細胞凋亡率、總凋亡率明顯增加，西藥組、聯合組尤其明顯（P＜0.05），表明中藥具有協同抑制劑增效的作用。干預SK-BR-3細胞48h后，各用藥組與對照組比較早期細胞凋亡率明顯增加，表明中藥具有促進細胞凋亡作用。干預細胞48h與24h后比較，西藥組、聯合組較中藥組晚期細胞凋亡率明顯增加，聯合組較單純抑制劑組晚期細胞凋亡率有所減少，表明聯合組具有降低抑制劑的毒性同樣發揮誘導細胞凋亡的作用。

綜上所述，解毒化濁方可能有誘導乳腺癌SKBR-3細胞凋亡，協同抑制劑減毒增效的發揮抑瘤作用。