潞黨參根際一株產ACC脫氨酶細菌的鑒定及促生長特性

任嘉紅，常 欣，白變霞，豐 敏

（長治學院 生物科學與技術系，山西 長治 046011）

1 引言

黨參是一種性平味甘的重要中藥，是桔梗科植物黨參（Codonopsis pilosula（Franch.）Nannf）的干燥根，其性味甘平、無毒，有補中益氣、生津止渴、活血化淤等功效[1]。黨參分布區域廣，產地多，質量差異較大，山西潞黨參為道地藥材[2]。潞黨參主要產于現山西長治和晉城的平順、陵川、黎城、武鄉、長治等縣[3]。營養需求和施肥管理是黨參人工栽培的理論基礎，目前施肥是人工栽培用來提高黨參產量和品質的主要措施[4-5]。目前，以微生物為基礎開發的各種微生物肥料已經在農業生產中得到廣泛應用，該類肥料具有肥效高、本身無毒、不污染環境、成本低、節約能源等特點，是化學肥料的最有效替代品[6]。

乙烯是植物體內的內源激素，植物大部分時候只需要低水平度乙烯，大量乙烯的生成會阻礙植物生長[7]。ACC 脫氨酶（ACC deaminase，1-氨基環丙烷-1-羧酸脫氨酶）可以降解乙烯合成的直接前體ACC使乙烯水平降低，就有可能解除高濃度乙烯對植物生長的抑制，從而促進植物的生長，有利于植物去抵抗逆境，ACC脫氨酶活性細菌可以分解植物根際產生的ACC[8，9]，該類菌不少菌株還具有一定的產生長素能力、解磷能力、產嗜鐵素能力，進而促進植物根的生長。近年來，ACC脫氨酶已成為國內外的研究熱點之一，具有ACC脫氨酶活性的微生物作為植物根際促生菌（PGPR）的潛力菌株，諸多實驗室開展了關于ACC脫氨酶活性細菌的篩選分離和ACC脫氨酶活性細菌功能作用等方面的研究。目前關于黨參根際產ACC脫氨酶菌株的研究未見報道。

本研究以前期從潞黨參根際土壤中分離出的一株具有ACC脫氨酶活性的菌株M01為研究對象，通過形態、生理生化、基于16S rDNA序列的系統發育分析等對該菌株進行鑒定，以確定其分類地位，并對其產ACC脫氨酶能力進行定性測定，同時還對該菌株解磷、產IAA、嗜鐵素能力等進行測定。本研究為黨參專用生物肥料的開發提供了良好的潛力菌株。以期為黨參生物肥料開發提供優良菌種，進而為黨參的人工栽培及野生資源保護以及我國植物資源多樣性保護提供理論基礎和技術支持。

2 實驗方法

2.1 材料

2.1.1 材料

菌株M01分離自山西省長治陵川潞黨參根際土壤中，該菌株目前保藏于本實驗室。

2.1.2 培養基

LB培養基，牛肉膏蛋白胨培養基，NB種子培養基，富集DF培養基，加富培養基ADF培養基[10]，鑒定培養基蒙金娜固體培養基、CAS培養基、MKB培養基[11]。

2.2 方法

2.2.1 菌株ACC脫氨酶活性測定方法

（1）將供試菌株接入50 mL LB液體培養基，28℃培養24 h進行活化后，按1%接種量接種至50 mL LB液體培養基，28℃擴大培養24 h，離心（9000 r/min，4℃）10 min收集菌體。用不加（NH4)2SO4的DF液體培養基離心洗滌菌體2次，重懸于25 mL ADF培養基中，28℃培養48 h，9000 r/min（4℃）離心10 min，收集菌體。用pH7.6的 Tris-Hcl緩沖液（0.1 mol/L）離心洗滌菌體2次。

（2）將菌體重懸于600 uL 0.1 mol/L Tris-Hcl緩沖液（pH=8.5）中，加入30 uL甲苯，迅速振蕩30 s，破碎細胞，即為粗酶液，取100uL粗酶液，4℃貯存，用于蛋白測定，其余粗酶液立即用于ACC脫氨酶活性測定。

（3）取200 uL粗酶液于1.5 mL離心管，加入20 uL 0.5 mol/L ACC混勻，置于30℃水浴15 min，隨即加入1 mL 0.56 mol/L Hcl終止反應。并設2組平行對照，不加粗酶液和不加ACC。12000 r/min離心5 min，取上清。

（4）在10 mL管中，每1 mL上清液加800 uL 0.56 mol/L HCl和300 vuL 0.2%2，4-二硝基苯肼溶液（濃硫酸中溶解），30℃保溫30 min，加入2 mol/L NaOH混勻，540 nm測吸光值。

（5）繪制α-酮丁酸標準曲線，使用Bradford蛋白定量試劑盒定量測定蛋白質，以牛血清蛋白作為標準蛋白做標準曲線[12]。采用下列公式計算ACC脫氨酶比活力：

2.2.2 菌株鑒定

（1）形態和生理生化鑒定

將M01接種于牛肉膏蛋白胨培養基平板上，28℃培養24 h，觀察其菌落形態特征。并對該菌株分別進行革蘭氏染色、芽孢染色及鞭毛染色。并參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》（第9版）及《常見細菌鑒定手冊》開展M01菌株的生理生化鑒定[13～15]。

（2）16SrDNA序列的測定與系統發育分析

采用修改CTAB法提取M01菌株的基因組DNA。以基因組DNA為模板，用細菌的16S rDNA通用引物對細菌基因組DNA進行PCR擴增[16]。引物分別為：PA（5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3）和 PB（5-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3）；采用50uL體系進行擴增。PCR擴增程序為：94℃2 min,94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，30個循環，72℃7min。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測獲得目的條帶（1500bp左右），將該條帶切膠回收后與pMD19-T載體連接，轉入大腸桿菌JM109感受態細胞中，采用藍白斑篩選和菌落PCR檢測，挑選出陽性克隆斑后送至北京華大基因進行測序，將得到的16S rDNA序列進行BLAST，并用MEGA 5.0構建該菌株系統發育樹。并將該序列提交至GenBank數據庫獲取基因登錄號。

2.2.3 M01菌株的促生潛力測定（1）溶磷能力的鑒定

將M01菌株點接種于蒙金娜固體培養基平板上，30℃培養7 d，觀察解磷圈，并統計解磷圈直徑（D）與菌落直徑（d）的比值，初步判定其解磷能力的大小。

將M01菌株活化后接種于NB種子培養基，30℃振蕩培養18～24 h制成種子液，取0.5 mL種子液接種于含50 mL蒙金娜液體培養基的100 mL三角瓶中，以接0.5 mL空白種子液的蒙金娜液體培養基為對照，每個處理3個重復，30℃，180 r/m振蕩培養 4 d后，發酵液（4℃，12857×g）離心 10 min，采用鉬銻抗比色法測定上清液有效磷含量[17]，同時計算溶磷率[18]；

（2）產生長素測定

參照文獻[19]中的方法對M01菌株進行分泌生長素（IAA）能力的定性定量鑒定。（3）產嗜鐵素測定

在CAS培養基上，對M01菌株進行點接種，30℃培養72 h，如果菌株周邊有黃綠色暈圈產生，即表明該菌株具有產嗜鐵素的能力。并對M01菌株產嗜鐵素進行定量測定，按1%的量接入到30 mL液體MKB培養基中，28℃、200 r/min培養 24 h后，離心（10,000 r/min，10℃）15 min取上清液，與等體積CAS藍色檢測液混勻。以不接菌的MKB培養液為對照。室溫下充分1h后，測定樣品（As）與對照（Ar）OD630的值，用如下公式計算鐵載體產量：

3 結果與分析

3.1 M01菌株產ACC酶菌株能力的測定

對M01菌株進行產ACC酶活力測定，測定發現該菌株所產的ACC脫氨酶的活性為11.5 U/mg。這說明該菌株產ACC脫氨酶能力較強。

3.2 M01菌株的鑒定

菌株M01接種于牛肉膏蛋白胨平板上培養24h后，長出的菌落不透明，較小，污白色，有光澤，圓形，邊緣整齊。該菌株桿狀，革蘭氏陽性，好氧、具運動性，不產芽孢；生理生化特征分別是：KOH實驗陰性、接觸酶陽性、氧化鎂陰性、卵磷脂酶陰性、油脂水解陰性、淀粉水解陰性、丙二酸鹽利用陽性、吲哚試驗陰性、甲基紅陽性、V·P陰性、硝酸鹽還原陽性。

3.3 M01細菌的16S rDNA序列分析結果與系統發育分析

以M01菌株16S rDNA的PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠（2%）電泳檢測，如圖1所示，在1500 bp附近有目的條帶。將該條帶進行切膠回收后與T載體連接，轉入大腸桿菌JM109感受態細胞中，采用藍白斑篩選和菌落PCR檢測，挑選出陽性克隆斑，送交測序公司進行測序。對M01菌株測序得到的16S rDNA序列進行BLAST比對，能在數據庫中找到同源性非常高的相似菌株系列，與Pseudomonas brassicacearum（EU391388）菌株的同源性達到99%。構建系統發育樹，可見菌株M01與模式菌株 Pseudomonasbrassicacearum（EU391388)處于同一分支上。因此，結合M01菌株的形態特征和生理生化鑒定的結果，可將其鑒定為Pseudomonas brassicacearum。將M01菌株的16S rDNA序列提交至GenBank數據庫，獲取登錄號為MG687531。

圖1M01菌株16S rDNA PCR產物電泳結果Fig.1 Result of 2%agarose gel electrophoresis of 16S rDNA PCR product of strain M01

圖2 菌株M01的16S rDNA全序列的系統發育樹形圖Fig.2 Phylogenetic tree of strain M01 based on its 16S rDNA sequences

3.4 M01菌株的促生長特性

3.4.1 M01菌株溶磷能力的鑒定

具有溶磷能力的菌株表現為在菌落周圍形成透明的溶磷圈。將M01菌株點接種于蒙金娜培養基檢測平板上，從圖3可以看出，平板上出現明顯的解磷透明圈。透明圈直徑（D）與菌落生長直徑（d）的比值表示解磷菌相對解磷能力的指標，可初步測定菌株解有機磷的效果[20]。M01菌株的D/d比為1.5。對其解磷能力進行定量測定，結果表明該菌株的對有機磷的解磷率可達到18.35%。這說明M01菌株是一株解有機磷能力強的產ACC脫氨酶菌株。

圖3.M01菌株產生的解磷圈Fig.3 The phosphate-dissolving zone of M01 strain

3.4.2 產生長素（IAA）能力

通過產IAA定性鑒定，由圖4可見，M01菌株具有一定的產生長素能力。對M01進行產生長素（IAA）定量測定，該菌株的產生的IAA可以達到5.381μg/mL。

圖4 M01菌株的產IAA能力Fig.4.IAA producing effect of M01 strain

3.4.3 產嗜鐵素能力的鑒定

產生嗜鐵素的菌株表現為在CAS平板接種菌落周圍形成橘黃色暈圈。采用產嗜鐵素檢測CAS平板對對M01菌株進行產嗜鐵素能力的定性測定，發現其具有非常明顯的產嗜鐵素能力，如圖5所示，M01菌株能在CAS平板形成橘黃色暈圈（嗜鐵圈），可合成嗜鐵素。對M01菌株在MKB液體培養基中的鐵載體產生能力進行測定，結果表明，該菌株在上清液中鐵載體含量為48.12%。

圖5 M01菌株的產嗜鐵素能力Fig.5.The production of siderophore by M01 strain

4 結論與討論

假單胞菌是報道的產ACC脫氨酶的常見屬[21-22]。國外學者已經證實，以ACC為唯一碳源且可以產生ACC脫氨酶的假單胞菌都是植物根際促生菌[23]。本實驗室前期從潞黨參根際分離篩選出一株具有ACC脫氨酶活性的細菌M01，經形態特征、生理生化及16S rDNA序列的測定與系統發育分析將其鑒定為假單胞菌屬的Pseudomonas brassicacearum。通過測定M01菌株的其它促生機制后發現，該菌株除了具有溶有機磷能力，還具有明顯的產鐵載體和產IAA能力。總體而說，菌株M01除具有較強的ACC脫氨酶活性外，還具有其他的一些促生機制，這說明M01菌株是一株很有潛力的植物促生菌，同時表明該菌株可能通過幾種機制共同起作用來發揮其促生作用。而幾種機制共同作用對黨參的促生作用的效果有待后續的植物回接實驗。另外，國內外開展了不少關于植物內生及根際產ACC脫氨酶細菌的研究，但是在該類菌的ACC脫氨酶作用機制、ACC脫氨酶活性影響因素等方面存在諸多欠缺，有待加強。

本研究首次開展了山西潞黨參根際具ACC脫氨酶活性菌株的相關研究。我們分離自潞黨參根際的M01菌株具有較好的ACC脫氨酶活性，這表明該菌株可利用乙烯的前體1-氨基環丙烷-1-羧酸（ACC）作為唯一氮源進行生長，是典型的含ACC脫氨酶的根際促生菌。M01菌株在分類地位上隸屬于假單胞菌屬中的Pseudomonas brassicacearum。目前關于Pseudomonas brassicacearum大多是作為植物病害生防菌進行報道[24-25]，我們的研究結果為其作為植物PGPR提供了更多證據。

通過對M01菌株其它促生機制的測定，發現該菌株具有較強的產嗜鐵素能力，這暗示該菌株一方面能通過分泌嗜鐵素，為植物生長提供鐵營養，植物達到更好生長的目的；另一方面產生的嗜鐵素結合鐵去競爭土壤中病原菌生存所需的鐵，從而抑制病原菌的生長。此外，M01產IAA能力和溶磷能力都很強，這暗示其可以在植物根際分泌較多的IAA和磷酸酯酶，促進植物的生長和提供給植物更多可利用的磷。不少研究證明，IAA在促進植物生長的同時還能提高植物的抗逆能力[26]。Bianco等發現接種高產IAA的苜蓿中華根瘤菌可以增強宿主的抗鹽性[27]。另外，關于M01菌株具體的定殖能力尚不確定，因而不能完全客觀的保證該菌株的實際利用和操作，只有通過開展進一步的宿主植物定殖研究，才能更有效的去利用該菌株。