左歸補(bǔ)髓生血方對(duì)再生障礙性貧血小鼠骨髓有核細(xì)胞凋亡的影響

張 鵬，何春玲，郭雨晨，李 瑋，董昌虎

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽(yáng) 712046；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，陜西 咸陽(yáng) 712000)

再生障礙性貧血(以下簡(jiǎn)稱“再障”)為一類骨髓造血能力低下、全血細(xì)胞減少，以貧血、出血、感染為主要臨床表現(xiàn)的骨髓造血功能衰竭的綜合疾病[1]。既往認(rèn)為其發(fā)病機(jī)制為造血干細(xì)胞的缺陷、自身免疫功能紊亂、造血微環(huán)境異常3個(gè)因素。隨著對(duì)其研究的深入，以T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫異常被傾向于認(rèn)為是再障的主要發(fā)病機(jī)制[2]。但不管是哪一種發(fā)病機(jī)制，其最終的結(jié)果是骨髓內(nèi)造血干細(xì)胞減少，造血功能發(fā)生衰竭。現(xiàn)階段針對(duì)再障的各種治療方法，最終目的是為了改善骨髓的造血功能，提高生活質(zhì)量。西醫(yī)以免疫抑制劑與雄激素為主治療再障。實(shí)踐證明，中醫(yī)藥單用或聯(lián)合西藥能夠提高再障的臨床療效并且降低毒性和不良反應(yīng)。本研究利用二甲磺酸丁酯聯(lián)合環(huán)磷酰胺復(fù)制再障小鼠模型，觀察左歸補(bǔ)髓生血方對(duì)再障模型小鼠的治療作用以及對(duì)骨髓中造血細(xì)胞凋亡的影響，旨在探究左歸補(bǔ)髓生血方對(duì)再障者骨髓中造血干細(xì)胞的改善作用。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)ICR雄性小鼠40只，體質(zhì)量18～22 g，平均體質(zhì)量18.5 g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[生產(chǎn)許可證編號(hào)：SCXK(陜)2012-003]提供。

1.2 主要試劑與藥品 左歸補(bǔ)髓生血方(黃牛骨髓 14 g，紫河車、熟地黃、山藥、枸杞子、山茱萸、川牛膝、鹿角膠、龜板膠、菟絲子各7 g)藥材由陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥劑科提供，經(jīng)水煎、濃縮、過(guò)濾，配制成約100 mL藥液，濃度約為1.54 g/mL，裝入干凈的100 mL塑料瓶后，置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆茫褂们俺浞謸u勻并煮沸。司坦唑醇(廣西壯族自治區(qū)南寧百會(huì)藥業(yè)公司，每片2 mg，每盒24片，國(guó)藥準(zhǔn)字號(hào)為H45020728，批號(hào)為1510027)：使用滅菌用水配制成0.12 mg/mL的懸混液；TUNEL試劑盒：上海Roche制藥公司；蛋白酶K工作液、DAB工作液、蘇木素-伊紅染色試劑盒：武漢賽維爾生物公司；二甲磺酸丁酯、環(huán)磷酰胺：上海索萊寶生物公司；二甲苯、梯度乙醇、中性樹(shù)膠、磷酸鹽緩沖液：天津天力化學(xué)試劑廠。

2 方法

2.1 模型復(fù)制、分組以及給藥 參考文獻(xiàn)[3-5]方法并加以改進(jìn)，小鼠適應(yīng)飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)選取10只設(shè)為正常組，其余30只小鼠用于復(fù)制再障模型，于第1、3、5、7、9、11天腹腔注射二甲磺酸丁酯10 mg/kg，第2、4、6、8、10、12天注射環(huán)磷酰胺20 mg/kg，模型復(fù)制時(shí)間為12 d。將復(fù)制成功的再障模型小鼠隨機(jī)分成模型組、中藥組與西藥組，各組12只小鼠，正常組與模型組給予等容量生理鹽水灌胃，中藥組以左歸補(bǔ)髓生血方藥液灌胃，根據(jù)成人等效劑量[6]換算為15.4 g/kg，西藥組給予司坦唑醇懸混液(給藥劑量為2.4 mg/kg)灌胃，中藥組與西藥組灌胃容積均為20 mL/kg，共灌胃15 d。

2.2 標(biāo)本采集 實(shí)驗(yàn)第28天，各組小鼠腹腔注射10%水合氯醛(10 mL/kg)進(jìn)行麻醉，麻醉后右眼摘取眼球，取血約1 mL，滴入經(jīng)肝素處理過(guò)的EP管后，置于全自動(dòng)動(dòng)物血細(xì)胞分析儀中檢測(cè)血常規(guī)；頸部脫臼處死小鼠，取其右側(cè)股骨，置10%甲醛中固定24 h，放入10% EDTA脫鈣液中脫鈣21 d，脫水，透明，石蠟包埋，制備4 μm切片。按照試劑盒說(shuō)明書，分別采用蘇木精-伊紅染色法和TUNEL法檢測(cè)股骨內(nèi)有核細(xì)胞凋亡。

置于光學(xué)顯微鏡下分別觀察骨髓組織病理切片以及凋亡細(xì)胞，細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者或胞漿或胞膜棕黃色為凋亡陽(yáng)性細(xì)胞。在400倍顯微鏡下，觀察凋亡細(xì)胞的分布，每組隨機(jī)選10個(gè)陽(yáng)性視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算平均凋亡細(xì)胞數(shù)所占百分比作為凋亡指數(shù)。

3 結(jié)果

3.1 各組小鼠外觀行為觀察 正常組小鼠的精神、行動(dòng)以及反應(yīng)良好，皮毛有光澤，口及四肢末端紅潤(rùn)，飲食正常；模型組小鼠精神萎靡，活動(dòng)減少伴扎堆，唇瓣灰白，毛色暗亂，飲食減少；中藥組與西藥組小鼠精神明顯好轉(zhuǎn)，飲食有所增加，皮毛較光澤。

3.2 各組小鼠外周血白細(xì)胞(white blood cell, WBC)、紅細(xì)胞(red blood cell, RBC)、血小板(platelet, PLT)計(jì)數(shù)和血紅蛋白(hemoglobin, Hb)濃度比較 與正常組比較，模型組小鼠外周血WBC、RBC、PLT計(jì)數(shù)和Hb濃度明顯減少(P<0.05)；與模型組比較，中藥組和西藥組外周血WBC、RBC、PLT計(jì)數(shù)和Hb濃度明顯升高(P<0.05)；中藥組和西藥組WBC、RBC、PLT計(jì)數(shù)和Hb濃度比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠外周血WBC、RBC、PLT計(jì)數(shù)和Hb濃度比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05

3.3 各組小鼠骨髓組織形態(tài)學(xué)變化比較 正常組小鼠骨髓細(xì)胞增生活躍，可見(jiàn)紅系、粒系和巨核系細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)均無(wú)明顯異常，可見(jiàn)巨核細(xì)胞和成簇血小板以及少量非造血性細(xì)胞，成熟紅細(xì)胞大小均勻，染色正常。與正常組比較，模型組小鼠骨髓增生極度減少，紅系、粒系、巨核細(xì)胞系均明顯減少，造血組織明顯減少，非造血細(xì)胞團(tuán)易見(jiàn)，可見(jiàn)到大量的脂肪空泡，并伴有明顯的充血現(xiàn)象。與模型組比較，中藥組以及西藥組小鼠骨髓增生程度好轉(zhuǎn)，紅系、粒系、巨核細(xì)胞系均有明顯增生，可見(jiàn)少量非造血組織及脂肪細(xì)胞，造血組織結(jié)構(gòu)明顯修復(fù)，空泡顯著減少。見(jiàn)圖1。

3.4 各組小鼠骨髓腔內(nèi)有核細(xì)胞凋亡率比較 與正常組比較，模型組小鼠骨髓內(nèi)大量空泡伴充血，有核細(xì)胞數(shù)顯著減少，TUNEL染色多為陽(yáng)性，凋亡率明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，中藥組和西藥組小鼠骨髓有核細(xì)胞顯著增加，骨髓腔內(nèi)充血及空泡減少，有核細(xì)胞凋亡率明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；中藥組與西藥組骨髓有核細(xì)胞凋亡率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2、圖2。

注：A.正常組；B.模型組；C.西藥組；D.中藥組

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05

注：A.正常組；B.模型組；C.西藥組；D.中藥組；紅色箭頭示凋亡細(xì)胞，凋亡細(xì)胞明顯固縮，核致密深染為棕黃色或棕褐色，呈均勻的顆粒狀

圖2各組小鼠骨髓中有核細(xì)胞凋亡情況(TUNEL法，DAB顯色后蘇木素染色，10×40倍)

4 討論

隨著再障發(fā)病率的逐年升高，對(duì)其具體發(fā)病機(jī)制的研究逐漸深入，取得了一系列階段性的成果，對(duì)于臨床診療具有極大的指導(dǎo)意義。基于再障在臨床上主要表現(xiàn)為一系或多系的血細(xì)胞減少，并伴有貧血、感染以及出血等的現(xiàn)實(shí)，當(dāng)前研究發(fā)現(xiàn)雖然再障的主要發(fā)病機(jī)制是T淋巴細(xì)胞的過(guò)度活化導(dǎo)致的免疫紊亂，但主要環(huán)節(jié)是造血干祖細(xì)胞在質(zhì)或量上的異常。在對(duì)再障發(fā)病機(jī)制的研究方面，無(wú)論是“種子”“土壤”學(xué)說(shuō)亦或是“蟲(chóng)子”學(xué)說(shuō)，都認(rèn)為是造血細(xì)胞的凋亡、壞死，引發(fā)骨髓中造血細(xì)胞的缺失，最終導(dǎo)致骨髓衰竭[7]。針對(duì)上述研究，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)復(fù)制再障小鼠模型，使用左歸補(bǔ)髓生血方進(jìn)行干預(yù)，旨在探究左歸補(bǔ)髓生血方對(duì)再障者骨髓中造血干細(xì)胞的改善作用。本次實(shí)驗(yàn)利用二甲磺酸丁酯聯(lián)合環(huán)磷酰胺成功復(fù)制再障模型小鼠，與正常組比較，外周血WBC、RBC、PLT等指標(biāo)明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；骨髓增生程度減低，造血細(xì)胞(紅系、粒系、巨核系)及造血組織均減少，非造血組織增多。司坦唑醇為蛋白同化類固醇類雄激素藥，是臨床治療再障的常用藥物，雄激素經(jīng)吸收后在體內(nèi)被還原成5α-雙氫睪酮和5β-雙氫睪酮，通過(guò)刺激腎臟產(chǎn)生紅細(xì)胞生成素(erythropoietin，EPO)，使靜止期造血干細(xì)胞向?qū)PO有反應(yīng)階段分化，并外源性補(bǔ)充EPO，增強(qiáng)造血細(xì)胞對(duì)EPO的反應(yīng)性，促進(jìn)骨髓造血[8]。本實(shí)驗(yàn)中加入司坦唑醇作為對(duì)照組，治療后小鼠一般狀況改善明顯，外周血中WBC、RBC、PLT計(jì)數(shù)和Hb濃度上升，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，骨髓腔內(nèi)造血組織增多，增生程度好轉(zhuǎn)，提示司坦唑醇能有效地治療再障。

細(xì)胞凋亡又稱“細(xì)胞程序性死亡”，正常組織通過(guò)細(xì)胞凋亡途徑可以清除體內(nèi)某些異常細(xì)胞，最終保持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的動(dòng)態(tài)平衡[9]。再障患者CD34+T細(xì)胞表面Fas抗原表達(dá)水平明顯增加[10]，推測(cè)再障患者可能存在造血細(xì)胞的過(guò)度凋亡。Fas(CD95+T細(xì)胞抗原)是一種膜蛋白，表達(dá)于細(xì)胞表面，當(dāng)與配體結(jié)合后，可以傳遞凋亡信號(hào)，引發(fā)骨髓CD34+T細(xì)胞發(fā)生大量凋亡，最后使造血功能衰竭[11]。因此，降低再障患者骨髓內(nèi)造血細(xì)胞凋亡是治療再障的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本研究結(jié)果表明，左歸補(bǔ)髓生血方明顯降低再障小鼠骨髓腔內(nèi)有核細(xì)胞凋亡率(P<0.05)，其作用與司坦唑醇相當(dāng)(P>0.05)，提示左歸補(bǔ)髓生血方能夠通過(guò)降低再障小鼠骨髓內(nèi)造血細(xì)胞凋亡而改善造血功能，緩解病情進(jìn)展。

根據(jù)再障所引起的貧血、出血、感染等典型癥狀，可將其歸屬為中醫(yī)學(xué)“虛勞”“髓勞”“血?jiǎng)凇钡确懂牎！端貑?wèn)·陰陽(yáng)應(yīng)象大論》提出“腎生骨髓”，腎為先天之本，受五臟六腑之精氣而藏之，主骨生髓，腎精充則化血，腎精虧則骨髓造血功能不足，導(dǎo)致生血障礙。閆昱江等因此提出“補(bǔ)腎為本、健脾益氣”治療再障的觀點(diǎn)[12]。左歸補(bǔ)髓生血方是在補(bǔ)腎名方左歸丸的基礎(chǔ)上，加入紫河車與牛骨髓而制成的自擬藥方。方中熟地黃滋腎填精，山藥、山茱萸滋補(bǔ)肝、脾；枸杞子補(bǔ)精，川牛膝補(bǔ)血，菟絲子補(bǔ)腎氣，鹿角膠、龜板膠為血肉有情之品，峻補(bǔ)精髓；紫河車補(bǔ)氣養(yǎng)血，牛骨髓補(bǔ)血益精、止渴、止血，用于精血虧損、虛勞羸瘦之證。全方共奏滋腎補(bǔ)陰、填精益髓、益氣養(yǎng)血之效。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，左歸補(bǔ)髓生血方可改善再障小鼠的一般狀況，顯著提高外周血WBC、RBC、PLT計(jì)數(shù)和Hb濃度(P<0.05)，使再障小鼠骨髓增生程度明顯恢復(fù)，造血組織比例明顯增加，并且與司坦唑醇組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示左歸補(bǔ)髓生血方對(duì)再障小鼠具有確切的療效。

綜上所述，本研究證實(shí)，左歸補(bǔ)髓生血方能夠改善再障模型小鼠的一般狀態(tài)，提升外周血象，抑制骨髓中造血細(xì)胞凋亡，改善并恢復(fù)造血功能，最終達(dá)到治療再障的作用。本研究為臨床應(yīng)用左歸補(bǔ)髓生血方治療再障提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。