加味地黃飲子對衰老小鼠腎臟組織P21、P53蛋白及其mRNA表達的影響

高 山，莊 哲，劉 釗，蔡國鋒，謝 寧，唐偉懿，馬 嫡，付 宇

(1.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，黑龍江 哈爾濱 150040； 2.黑龍江中醫藥大學附屬第二醫院，黑龍江 哈爾濱 150001； 3.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

衰老是所有生物都會發生的隨時間出現的增齡性變化，從微觀的細胞改變到宏觀的器官衰老、功能下降，包括人體的全部生理病理變化[1]。老齡導致的生理改變與某些疾病的初期病理變化在時間上無明顯分界，老齡化導致的器官功能衰竭逐漸演變成臨床疾病。在中國，11%的65歲以上老年人存在慢性腎臟疾病，衰老腎臟對外界環境的刺激缺乏抵抗能力，易遭到破壞[2-3]。因而，研究腎臟衰老機制及探究衰老腎臟的保護方法具有重要的意義。

加味地黃飲子源自古方地黃飲子。課題組針對疾病譜系和現代人的體質，對其進行加減化裁，在臨床應用和前期研究中發現其具有良好的延緩衰老作用。目前，對中醫藥延緩衰老的深層機制的研究較少[4-5]。本研究從衰老基因表達的角度，探討加味地黃飲子延緩腎臟衰老的作用機制，為其廣泛應用提供理論依據。

1 材料

1.1 動物 清潔級ICR雄性小鼠40只，2月齡10只，體質量20～25 g，18月齡30只，體質量35～40 g，由黑龍江中醫藥大學動物實驗中心[動物生產許可證號為SCXK(黑)2012-001]提供。飼養條件：20～25 ℃，自然照明，自由飲水和進食。

1.2 藥物、試劑與儀器 加味地黃飲子水煎液(生藥濃度為0.26 g/mL)：黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院中藥局；水溶性維生素E(批號 1420006707)：北京博奧拓科技有限公司；P21單克隆抗體(批號 028359)：美國Santa Crcz公司；P53單克隆抗體(批號 029457)：美國Thermo公司；β-actin鼠單克隆抗體(批號 040521)：武漢博士德公司；逆轉錄試劑盒(批號 1601259)：上海默聯生物科技有限公司。

7050型全自動生化分析儀：日本日立公司；超聲碎裂儀：美國Sonic公司；EnVision?多功能酶標儀：上海珀金埃爾默有限公司；DNA電泳儀：美國BR公司；Image Plus version 5.0圖像分析系統：美國Gybernetics公司。

2 方法

2.1 分組與給藥 將2月齡小鼠10只設為青年組。18月齡小鼠被隨機分為老年組、維生素E組、加味地黃飲子組，每組10只。青年組和老年組按每日10 mL/kg劑量灌胃生理鹽水，維生素E組按每日250 mg/kg劑量灌胃維生素E水溶液，加味地黃飲子組按每日2.6 g/kg劑量灌胃加味地黃飲子水煎劑。以上各組連續灌胃60 d。

2.2 標本采集與處理 實驗結束后麻醉小鼠，腹主動脈取血，收集血液標本。處死小鼠，收集腎臟標本并稱質量，一部分石蠟包埋處理，另一部分液氮冷凍后在-80 ℃冰箱中保存。

2.3 一般狀況觀察和腎臟指數檢測 觀察實驗前后各組小鼠毛色、運動、反應、體質量等一般狀況。計算各組小鼠平均腎臟指數。計算公式：腎臟指數=腎臟質量(mg)/體質量(g)×100%。

2.4 血清肌酐(serum creatinine, SCr)、尿素氮(blood urine nitrogen, BUN)檢測 采用日立7050生化分析儀檢測各組小鼠SCr、BUN水平。

2.5 腎臟組織病理學觀察 制備腎臟組織石蠟切片(厚度2～3 μm)，常規脫蠟，蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin， HE)染色，觀察腎小球、腎小管、基質等病理改變。

2.6 腎臟組織超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)水平檢測 將腎臟組織勻漿，離心后收集上清液，以酶學方法檢測SOD、GSH-Px水平，以硫代巴比妥酸法檢測MDA水平。

2.7 RT-PCR法測定P21、P53 mRNA的表達 引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列見表1。按RT-PCR試劑盒提供方法操作，以Trizol提取總RNA，逆轉錄合成cDNA，采用實時熒光定量PCR法檢測。反應體系：cDNA 2 μL，上下游引物各2.5 μL，總反應容積為20 μL。反應條件：95 ℃預變性1 min，95 ℃變性15 min，60 ℃退火1 min，70 ℃延伸30 s，40個循環。

2.8 Western blot法測定P21、P53蛋白的表達 采用BCA法檢測腎臟組織蛋白濃度。每孔上樣50 μg蛋白樣本，SDS-PAGE電泳、分離、轉印，轉膜封閉，經過一抗、二抗孵育處理，洗膜后曝光。以同一膜上GAPDH作為內參,在凝膠成像處理系統內進行圖像分析。

表1 RT-PCR引物序列

3 結果

3.1 各組小鼠一般狀況及腎臟指數變化 實驗前，青年組小鼠毛色潔白，運動活躍，反應迅速；老年組與維生素E組和加味地黃飲子組小鼠毛色白，運動平穩，反應靈敏。60 d后，青年組小鼠毛色、運動、反應無明顯變化，體質量增加明顯；老年組小鼠毛色淡黃，運動緩慢，反應遲鈍，體質量略增加；維生素E組與加味地黃飲子組小鼠毛色淡黃，運動平穩，反應靈敏，體質量略增加，且加味地黃飲子組小鼠運動、反應表現優于維生素E組。

與青年組比較，老年組小鼠腎臟指數顯著升高(P<0.05)；與老年組比較，維生素E組腎臟指數無明顯差異，加味地黃飲子組腎臟指數明顯降低(P<0.05)。與維生素E組比較，加味地黃飲子組腎臟指數明顯降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組小鼠體質量及腎臟指數比較

注：與青年組比較，*P<0.05；與老年組比較，#P<0.05；與維生素E組比較，△P<0.05

3.2 各組小鼠SCr、BUN水平比較 與青年組比較，老年組SCr、BUN水平顯著上升(P<0.05)；與老年組比較，維生素E組小鼠SCr、BUN水平無明顯變化，加味地黃飲子組小鼠SCr、BUN水平顯著降低(P<0.05)；與維生素E組比較，加味地黃飲子組小鼠SCr、BUN水平顯著降低(P<0.05)。見表3。

3.3 各組小鼠腎臟病理學變化 青年組小鼠無腎小球硬化、腎小管萎縮、系膜基質增生、炎性細胞浸潤表現。老年組小鼠出現腎小球硬化、腎小管萎縮、系膜基質增生、炎性細胞浸潤。與老年組比較，維生素E組和加味地黃飲子組硬化腎小球數目減少，腎小管萎縮、系膜基質增生、炎性細胞浸潤減輕，加味地黃飲子組病理變化的改善情況優于維生素E組。見圖1。

表3 各組小鼠SCr、BUN水平比較

注：與青年組比較，*P<0.05；與老年組比較，#P<0.05；與維生素E組比較，△P<0.05

注：A.青年組；B.老年組；C.維生素E組；D.加味地黃飲子組

圖1各組小鼠腎臟組織病理學變化比較(HE染色，10×20倍)

3.4 各組小鼠腎組織SOD、MDA、GSH-Px水平比較 與青年組比較，老年組小鼠腎組織SOD、GSH-Px水平顯著下降，MDA水平顯著上升(P<0.05)。與老年組比較，維生素E組小鼠腎組織SOD水平明顯上升(P<0.05)，GSH-Px、MDA水平無明顯變化(P>0.05)；加味地黃飲子組SOD、GSH-Px水平顯著上升，MDA水平明顯降低(P<0.05)。與維生素E組比較，加味地黃飲子組SOD、GSH-Px水平顯著上升，MDA水平顯著降低(P<0.05)。見表4。

表4 各組小鼠腎組織SOD、MDA、GSH-Px水平比較

注：與青年組比較，*P<0.05；與老年組比較，#P<0.05；與維生素E組比較，△P<0.05

3.5 各組小鼠腎組織P21、P53及其mRNA表達水平比較 與青年組比較，老年組小鼠腎組織P21、P53及其mRNA表達水平顯著升高(P<0.05)。與老年組比較，維生素E組和加味地黃飲子組小鼠腎組織P21及P21 mRNA、P53 mRNA表達水平明顯降低(P<0.05)。加味地黃飲子組P21、P53及其mRNA表達水平明顯低于維生素E組(P<0.05)。見表5和圖2。

表5 各組小鼠腎組織P21、P53及其mRNA相對表達水平比較

注：與青年組比較，*P<0.05；與老年組比較，#P<0.05；與維生素E組比較，△P<0.05

注：A.青年組；B.老年組；C.維生素E組；D.加味地黃飲子組

圖2各組小鼠腎組織P21、P53蛋白表達水平比較(Western blot法)

4 討論

WTO將亞太地區60歲以上者劃分為老年人。隨年齡增長，人體各器官都會逐漸衰老，腎臟是較早衰老的器官之一。衰老后的腎臟解剖結構、生理代謝方面發生退行性變化，導致腎臟發生老年性功能改變[6]。但通常狀態下，老年腎臟仍能維持穩態，可是一旦出現某些疾病使腎臟負荷加重，使內環境不穩定，老年人的腎臟功能就會出現異常，甚至衰竭。近年來中國才開始研究腎臟衰老，其意義受到日益廣泛的關注。

地黃飲子原方出自《黃帝素問宣明論方》，由熟地黃、山茱萸、石菖蒲、巴戟天、五味子、石斛、遠志等組成。本方具有滋補腎陰腎陽、化痰開竅的功效，主治下元虛衰、陰陽兩虛、痰濁上犯之證。熟地黃滋陰養血、益髓補精，主補血氣、滋腎水、益真陰。山茱萸平補陰陽，壯元氣，秘精。巴戟天為補腎要劑，可強陽益精。本課題組結合現代人體質特點化裁原方，去掉附子等過于溫熱的藥物。研究發現，地黃飲子可以升高膽堿乙酰轉移酶(choline acetyltransferase，ChAT)的表達，減輕膽堿能系統的損害[7-8]。宮健偉等研究發現，地黃飲子具有明顯升高大鼠血清中SOD、CAT、GSH-Px和抑制MDA的作用，減少自由基的產生，減輕脂質過氧化反應，具有良好的抗氧化損傷作用[9]。程小麗等[10]研究發現，加味地黃飲子具有上調熱休克蛋白和核轉錄因子的作用。劉瑩等[11]研究表明，地黃飲子可以調控蛋白激酶B、果蠅雷帕霉素靶蛋白的表達而干預果蠅細胞的凋亡。

課題組前期研究發現，地黃飲子加減方具有抗海馬組織衰老的作用[12]。本實驗是在前期研究基礎上的延伸性研究。地黃飲子加減方可調節腦組織SOD、MDA、GSH-Px含量，表現出較明顯的抗氧化作用，其作用機制與抑制氧化應激有關，故以維生素E組作為對照組。本實驗結果顯示，自然衰老的老年組小鼠出現明顯的衰老性外觀變化，腎臟指數上升，腎功能及反映機體衰老的SOD、GSH-Px、MDA酶學指標發生改變，病理學觀察發現小鼠腎小球硬化數量增多，腎小管萎縮，間質大量增生，說明這一模型充分模擬了衰老的人體內環境。加味地黃飲子組小鼠的外觀性變化，腎臟指數，腎功能以及酶學指標SOD、GSH-Px、MDA的改善顯著優于老年組和維生素E組，腎小球硬化數量減少，腎小管萎縮、腎間質增生減輕，說明加味地黃飲子可以對小鼠腎臟組織的衰老產生干預作用。

與生化指標、病理學改變相對應，衰老標志物P21、P53及其mRNA表達在加味地黃飲子組明顯下降，說明其可能通過干預細胞調控因子，影響細胞增殖周期，而發揮抗衰老作用。P21、P53是細胞周期調節因子，其蛋白表達與衰老直接相關[13]。當細胞受到某種外界刺激時，P53蛋白應激性快速上調，進一步激活P21蛋白，使P21蛋白磷酸化受到抑制，正常細胞周期受阻，產生細胞衰老[14-15]。本研究結果表明，加味地黃飲子干預后小鼠P21、P53 mRNA表達水平明顯降低，推測加味地黃飲子可能通過下調P21、P53基因表達來延緩衰老。

綜上，本研究表明，加味地黃飲子可以干預小鼠衰老腎臟組織結構，調節P21、P53蛋白及其mRNA表達，可初步揭示其抗衰老的作用機制。